منابع مقاله درباره مورفولوژی، تجزیه و تحلیل آماری، اکسیداسیون

دانلود پایان نامه ارشد

ها به مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار داده شد.
4)نمونه ها در دور 10000 سانتریفوژ شده و محیط روئی برای اندازه گیری بیوشیمیائی مورد استفاده قرار گرفت.

2-8-4-1-2 مراحل انجام اندازهگیری میزان کلسیم:
1) ابتدا دستگاه توسط محلول بلانک (20 میکرولیتر آب مقطر+ 1000 میکرولیتر محلول معرف شماره 1) صفر گردید.
2) 20 میکرولیتر نمونه استاندارد با 1000 میکرولیتر محلول معرف شماره 1 مخلوط و جذب اولیه آن را با کمک دستگاه اسپکتوفتومتر (مدلT80+ ساخت شرکت PG instrument کشور انگلستان) (شکل 2-23) در طول موج 570 نانومتری قرائت و پس از 20 دقیقه محلول شماره 2 را اضافه نموده و جذب ثانویه یادداشت گردید.
3) 20 میکرولیتر از نمونههای کنترل و تیماری استئوژنیک و غیر استئوژنیک را با 1000 میکرولیتر محلول شماره 1 مخلوط و جذب اولیه را قرائت و پس از 20 دقیقه محلول شماره 2 اضافه و جذب ثانویه هر کدام یادداشت گردید.
4) غلظت کلسیم نمونه های غیر استئوژنیک با قرار دادن جذبهای حاصل در فرمول y=0/0658x-0/0216 و R^2=0/996 بصورت mg/dl گزارش گردید (A2-24) و در نمونه های استئوژنیک غلظت کلسیم با قرار دادن جذب های حاصل در فرمول y=0/0763x-0/0039 و R^2=0/999 بصورت بصورت mg/dl گزارش گردید (B2-24( .

2-24: نمودار استاندارد کلسیم (A): در نمونه های غیر استئوژنیک (B): در نمونه های استئوژنیک

2-25 :دستگاه اسپکتوفتومتر
سدیم و پتاسیم:
حفظ هوموستاز آب برای زندگی تمام موجودات زنده حیاتی است. در پستانداران، حفظ فشار اسمزی و توزیع آب در بخشهای مختلف مایع سلول، اغلب ناشی از عملکرد چهار الکترولیت سدیم (Na+)، پتاسیم (K+)، کلر(Cl-) و بیکربنات ( HCO3 -) میباشد. این الکترولیتها علاوه بر هوموستازی آب، نقش مهمی را، 1) در حفظ pH، 2) عملکرد مناسب غشاء، 3) واکنشهای اکسیداسیون-احیا، 4) به عنوان کوفاکتور برای آنزیمها ایفا میکند.
سدیم کاتیون اصلی مایع خارج سلولی است، از این رو سدیم دارای عملکرد مرکزی در حفظ توزیع طبیعی آب و فشار اسموتیک در مایع خارج سلولی (ECF) است. در سلولهای بافتی غلظت میانگین آن 150 میلی مول بر لیتر میباشد. غلظتهای بالای درون سلولی پتاسیم از طریق پمپ –K+ATPase Na+ حفظ میگردد که انرژی آن از طریق انرژی اکسیداتیو تامین شده و به طور مداوم K+ را بر خلاف شیب غلظت به درون سلول انتقال میدهد (106).

2-8-4-2 اندازهگیری غلظت سدیم و پتاسیم سلول استئوژنیک و غیر استئوژنیک:
فلیم فتومتر:
به منظور اندازهگیری غلظت پتاسیم و سدیم داخل سلولی از دستگاه فلیم فتومتر92 (فتومتر شعلهای ) استفاده کردیم (شکل 2-27). اساس کار این دستگاه مثل اسپکتروفتومتر بر روی سنجش انرژی نورانی و طیف نشری اتمهای مورد نظر است. الکترونهای اتم فلزات به ویژه فلزات قلیایی مانند سدیم و پتاسیم بر اثر انرژیهای مختلف مانند حرارتی برانگیخته میشوند و به مدارهای بالاتر جهش میکنند. در روش فلیم فتومتری شدت نور حاصله از اتمهای تحریک شده اندازهگیری میشود (شکل 2-26).
فلزات قلیایی را میتوان به آسانی با شعله معمولی تحریک کرد. رنگ شعله سدیم زرد، پتاسیم بنفش میباشد. این رنگها مشخص کاتیونهای موجود در محلول است. تحت شرایط ثابت و کنترل شده، شدت نور طول موجهای اختصاصی که توسط هر اتم ایجاد میشود مستقیما با تعداد اتمهایی که انرژی از خود انتشار میدهند متناسب میباشد و آن نیز به نوبه خود متناسب با غلظت کاتیون موجود در محلول است.

اجزا دستگاه فتومتر شعلهای(فلیم فتومتر):

شکل 2-26 : نمای شماتیک دستگاه فلیم فتومتر(blogs.yahoo.co.jp).

شکل 2-27: دستگاه فلیم فتومتر
مراحل انجام تست های سدیم و پتاسیم:
1- نمونه‌های شاهد و تیمار شده سلولهای مزانشیم با دوزهای 6 نانو، میکرو و میلیگرم بر میلیلیتر اسید بوریک پس از طی مراحل ترپسین زنی (مراجعه شود به بخش 2-2-1) از کف ظروف کشت جدا و طی مراحل مشروحه در زیر محتوی سلول آنها استخراج شد. سلولهای شاهد و تیمار شده استئوژنیک با دوزهای 6 نانو و میکروگرم بر میلی لیتر اسید بوریک توسط بافر Tris-Hcl-Nacl (رجوع شود به 5-9) شستشو داده شد. پس از تراشیده شدن با اسکالپر از کف ظرف جدا و سپس توسط ترازو توزین و به مقدار مساوی بر اساس وزن تر در اپندورف قرار گرفت.
3- 50 میکرو لیتر از بافر استخراج Tris-Hcl (رجوع شود به 5-10) به نمونه‌ها اضافه شد.
4- سپس نمونه‌ها در 12000 دور (rpm) به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شده؛ و محلول رويي كه حاوي محتوی داخل سلول بود، جدا و برای بررسی های بیوشیمیائی استفاده شد.
پس از بدست آوردن عصاره:
مراحل کالیبراسیون و اندازه گیری جذب سدیم:
1) جهت خواندن جذب سدیم، دستگاه فلیم فتومتر (مدل PFP7 ساخت کشور انگلستان) بر روی فیلتر سدیم تنظیم شد.
2) به منظور رسم منحنی استاندارد غلظت های متفاوت محلول سدیم کلرید را به دستگاه داده و جذب نمونه ها اندازه گیری و منحنی استاندارد سدیم رسم شد (شکل 2-28).
3) جذب نمونه های سلولی در طول موج فیلتر سدیم اندازه گیری شد.
4) غلظت سدیم نمونه ها با قرار دادن جذب های حاصل در فرمول خطی y=0/0173x+0/021 و R^2=0/9921بر حسب میکروگرم بر میلیلیتر بیان گردید.

2-28: نمودار استاندار سدیم
مراحل کالیبراسیون و اندازه گیری جذب پتاسیم:
1) جهت خواندن جذب پتاسیم، دستگاه فلیم فتومتر (مدل PFP7 ساخت کشور انگلستان) بر روی فیلتر پتاسیم تنظیم شد.
2) به منظور رسم منحنی استاندارد غلظت های مختلف محلول پتاسیم کلرید را به دستگاه داده و جذب نمونه ها اندازه گیری و منحنی استاندارد پتاسیم رسم شد (شکل 2-29).
3) جذب نمونه های سلولی در طول موج فیلتر پتاسیم اندازه گیری شد.
4) غلظت پتاسیم نمونه ها، با قرار دادن جذب های حاصل در فرمول خطی y=0/4803x+0/0223 و R^2=0/996بر حسب میکروگرم بر میلیلیتر بیان گردید.

2-29: نمودار استاندارد پتاسیم
2-9 تجزیه و تحلیل آماری داده ها
داده های بدست آمده با استفاده از نرم افزار آماری SPSS و با استفاده از روش ANOVA یک طرفه و تست tukey تجزیه و تحلیل شد و تفاوت میانگین ها به صورت mean ±SD گزارش و در سطح P≤0/05 معنی دار در نظر گرفته شد.

فصل سوم
نتایج

فصل سوم
نتایج

مقدمه
در این مطالعه پس از استخراج و تکثیر سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت، در مرحله اول: به بررسی اثر تیمار دوزهای 6/0، 3 و 6 نانو، میکرو و میلیگرم بر میلیلیتر اسید بوریک در طی مدت زمان 12، 24 و 36 ساعت بر توانایی زیستی سلولها توسط رنگآمیزی تریپانبلو و تست رنگسنجی MTT به منظور یافتن دوز موثر پرداخته شد. سپس بر اساس نتایج مرحله دوزیابی، دوزهای 6 نانو، میکرو و میلیگرم بر میلیلیتر اسید بوریک برای بررسی توانایی کلونزایی و میزان دوبرابرشدگی جمعیت، تغییر در ویژگیهای مورفولوژیکی سلولهای تیمارشده با استفاده از رنگهای فلورسنس، فاکتورهای بیوشیمیایی مانند میزان آنزیمهای متابولیکی و میزان کلسیم با کیتهای مخصوص سنجیده شد. میزان سدیم و پتاسیم سلولی با دستگاه فلیم فتومتر اندازه گیری شد. در مرحله دوم: اثر دوزهای 6 نانو و میکروگرم بر میلیلیتر در مدت زمانهای 5، 10، 15 و 21 روز بر تمایز سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان به استئوبلاست با استفاده از تست MTT برای بررسی توانائی حیات،با استفاده از رنگ فلوروسنت هوخست و آکریدین اورنژ برای بررسی مورفولوژی، بررسی میزان کلسیم در ماتریکس با استفاده از کیت تجاری، فعالیت آنزیمهای متابولیکی و آلکالین فسفاتاز با استفاده از کیت تجاری و همچنین میزان معدنی شدن به روش کمی و کیفی آلیزارین رد مورد ارزیابی قرار گرفت که نتایج به شرح زیر ارائه شده است.
3-1 الف: نتایج مرحله اول
3-1-1 رشد و تکثیر سلولهای بنیادی مزانشیم
بر اساس مشاهدات میکروسکوپی سلولها یک روز پس از استخراج به کف فلاسک چسبید، این سلولها دوکی شکل و دارای زوائد سلولی کمی بودند. سلولها به تدریج و پس از گذشت 9-7 روز، تراکم یافته و شروع به پوشاندن کف ظرف نمودند. این سلولها پس از اولین پاساژ اندکی بزرگتر شده و پس از گذشت یک هفته، آماده برای دومین پاساژ بودند. سلولهای پاساژ دوم نیز بزرگتر و تعداد زوائد سلولی در آنها افزایش یافته بود. بعد از گذشت 6-5 روز این سلولها نیز تراکم یافتند و به مرحله پاساژ سوم رسیدند. سلولهای پاساژ سوم چندوجهی بوده و هستههای قابل تشخیص داشتند (شکل3-1) که از آنها برای مطالعات بعدی استفاده شد.

3-1-2 اثر اسید بوریک بر توانایی زیستی سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت
3-1-2-1 توانایی زیستی سلولهای مزانشیم بر پایه جذب تریپان بلو
آنالیز آماری دادهها به روش یک طرفه نشان داد که اسید بوریک بر توانایی زیستی سلولهای مزانشیم مغز استخوان دارای تاثیر معنی داری (p<0/05) بوده است (جدول 3-1). مقایسه میانگین توانایی زیستی سلولها نشان داد که پس از گذشت 12 ساعت از دوز 6 میکروگرم بر میلیلیتر تا 6 میلیگرم بر میلیلیتر اسید بوریک نسبت به کنترل تفاوت معنیدار (p<0/05) مشاهده شد اما نسبت به هم تفاوت معنیدار نشان نداد ((p>0/05. این در حالی است که دوزهای 6/0 نانوگرم تا 3/0 میکروگرم بر میلیلیتر در مدت زمان 12 ساعت نسبت به کنترل و یکدیگر تفاوت معنیدار نشان نداد ((p0/05.

شكل3-1. مراحل رشد سلول‌هاي بنيادي مزانشيم طي پاساژ‌هاي مختلف، a) سلول‌هاي بنيادي مزانشيمي پس از دو روز از استخراجb ) پس از اولين پاساژ c) بعد از دومين پاساژ d) پس از سومين پاساژ (بزرگ نمايي 20X) (اقتباس از پایان نامه خانم مژگان براتی).

در 24 ساعت از دوز 6/0 میکروگرم تفاوت معنیدار (p<0/05) با کنترل مشاهده شد و از این دوز تا دوز 6/0 میلیگرم بر میلیلیتر نسبت به هم تفاوت معنی دار نشان نداد ((p>0/05. در صورتی که در همین زمان دوز 3 و 6 میلیگرم بر میلیلیتر نسبت به دوزهای پیشین دارای تفاوت معنیدار (p<0/05) بودند. اگرچه هنوز در تیمار 36 ساعت دوزهای 6/0 و 3 نانوگرم با کنترل و یکدیگر تفاوت معنیدار ((p>0/05 نداشتند ولی از دوز 6 نانوگرم تا دوز 6 میلیگرم بر میلیلیتر نسبت به کنترل تفاوت معنیدار (p<0/05) دیده شد. این در حالی است که هر سه دوز 6/0، 3 و 6 میلیگرم بر میلیلیتر نسبت به یکدیگر نیز تفاوت معنیدار (p<0/05) نشان داد. جدول 3-1 مقایسه میانگین توانایی زیستی سلول ها پس از تیمار 12، 24 و 36 ساعته با دوزهای مختلف اسید بوریک توسط رنگ آمیزی تریپانبلو. زمان(ساعت) دوز
12
24
36
0
〖99/33〗^a±2/57
〖98/4〗^a±1/75
〖99/33〗^a±3/57
0/6ng/ml
〖99/00〗^a±1/96
〖98/23〗^a±0/15
〖98/00〗^a±1/73
3ng/ml
〖98/33〗^a±1/57
〖97/86〗^a±0/70
〖97/66〗^a±1/15
6ng/ml
〖98/06〗^a±0/11
〖97/70〗^a±0/62
〖97/03〗^b±0/05
0/6 µg/ml
〖97/66〗^a±0/29
〖97/00〗^a±0/57
〖96/66〗^b±0/57
3 µg/ml
〖97/66〗^a±0/57
〖97/00〗^a±0/11
〖96/66〗^b±0/00
6 µg/ml
〖97/00〗^a±0/15
〖96/66〗^b±1/5
〖96/62〗^b±2/64
0/6 mg/ml
〖97/00〗^a±2/00
〖96/66〗^b±0/00
〖96/00〗^c±3/00
3mg/ml
〖96/67〗^b±2/50
〖96/00〗^c±0/2
〖95/30〗^d±1/15
6mg/ml
〖96/50〗^b±1/00
〖95/86〗^c±1/00
〖92/3〗^e±2/50
مقادیر به صورت mean±SD می باشد. میانگین ها با کد حرفهای متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنی دار می باشد (p<0/05، Tukey test، one way ANOVA). 3-1-2-2 روش MTT (رنگسنجی)
در این مطالعه نتایج تست MTT نیز در تایید نتایج تریپانبلو نشان داد که توانایی زیستی سلولها وابسته به زمان است (جدول 2). کاهش معنی دار توانائی زیستی سلولها در تیمار 12 ساعته از دوز 6 میکروگرم شروع شد، در حالی که دوزهای 6/0 نانوگرم تا 3 میکروگرم بر میلیلیتر نسبت به کنترل و همچنین نسبت به یکدیگر تفاوتی معنی داری ( (p>0/05نداشتند. این کاهش معنی دار (p<0/05) در تیمار 24 ساعته از 6 نانوگرم و در 36 ساعته از دوز 6/0 نانوگرم مشاهده شد. تونائی زیستی سلولها در 36 ساعت توسط دوزهای 6/0، 3 و 6 میلی گرم بر میلی لیتر اسید بوریک نیز نسبت به هم دارای تفاوت معنی دار بودند (p<0/05).
جدول 3-2 مقایسه میانگین توانایی زیستی سلول ها پس از تیمار 12، 24 و 36 ساعته با دوزهای مختلف اسید بوریک توسط تست MTT.

زمان(ساعت)
دوز
12
24
36
0
〖32/68〗^a±0/59
〖34/56〗^a±0/10
〖34/93〗^a±0/31
0/6ng/ml
〖32/06〗^a±0/68
〖34/06〗^a±0/22
〖28/06〗^b±0/34
3ng/ml
〖31/43〗^a±0/43
〖34/03〗^a±0/06
〖27/81〗^b±0/22
6ng/ml
〖31/31〗^a±0/56
〖33/12〗^b±0/25
〖27/75〗^b±0/25
0/6 µg/ml
〖31/20〗^a±0/78
〖33/12〗^b±0/43
〖27/70〗^b±0/34
3 µg/ml
〖31/12〗^a±0/81
〖33/12〗^b±0/43
〖27/68〗^b±0/25
6 µg/ml
〖30/62〗^b±0/43
〖29/77〗^c±0/15
〖26/50〗^c±0/16
0/6 mg/ml
〖30/37〗^b±0/62
〖29/75〗^c±0/16
〖26/37〗^c±0/40
3mg/ml
〖30/75〗^b±0/37
〖29/68〗^c±0/12
〖23/93〗^d±0/22
6 mg/ml
〖30/06〗^b±0/66
〖29/56〗^c±0/06
〖22/75〗^e±0/22
مقادیر به صورت mean±SD می باشد. میانگین ها با کد حرفهای متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنی دار می باشد (p<0/05، Tukey test، one way ANOVA). تعداد سلولها (mean×103). 3-1-3 انتخاب دوز موثر
با توجه به نتایج به دست آمده از روشهای رنگآمیزی تریپانبلو و رنگ سنجی MTT، از آنجائی که در مدت زمان 36 ساعت اثر مسمومیت دوزهای متفاوت اسید بوریک مشهود تر بود (بصورتی که حتی دوزهای نانوگرم بر میلی لیتر اسید بوریک نیز دارای اثر سوء بودند)، لذا زمان 36 ساعت برای ادامه مطالعه انتخاب شد. از طرفی برای بررسی طیف وسیع از دوزها به عنوان نماینده دوزهای6 نانو، میکرو و میلی گرم در زمان 36 ساعت برای ادامه بررسیها به عنوان دوزهای تیماری در نظر گرفته شد.

3-1-4 بررسی مورفولوژی سلولهای تیمار شده
در مدت زمان 36 ساعت تغییرات مورفولوژیک هسته سلولها شامل متراکم شدن، شکستگی و تغییر شکل هسته در مقایسه با کنترل در گروه های تیماری 6 میکرو و میلی گرم بر میلی لیتر مشاهده شد (شکل شماره 2-3). علاوه بر نتایج میکروسکوپی، در آنالیز آماری داده ها نیز کاهش معنی دار ( p<0/05 ) قطر هسته ها (جدول 3) بصورت وابسته به دوز نسبت به گروه کنترل 6 نانوگرم بر میلی لیتر دیده شد. رنگ آمیزی آکریدین اورنژ تغییرات رخ داده در سیتوپلاسم و موقعیت هسته و سیتوپلاسم را نسبت به هم نشان داد که طبق نتایج حاصل در گروه کنترل، شکل سیتوپلاسم چندوجهی و زوائد سلولی قابل تشخیص بود و هستههای آنها در موقعیت مرکزی نسبت به سیتوپلاسم قرار داشتند. در حالی که رنگ آمیزی آکریدین اورنژ چروکیدگی و کوچک شدن سیتوپلاسم را در دوز های 6 میکرو و میلی گرم بر میلی لیتر در مقایسه با کنترل نشان داد، این در حالی است که این تغییرات در دوز 6 نانو گرم نسبت به کنترل مشاهده نمیشود (شکل شماره 3-3). از طرفی نیز در دوزهای 6 میکرو و میلی گرم بر میلی لیتر موقعیت هسته تا حدودی دستخوش تغییر مکان شده است. پیرو مشاهدات میکروسکوپی، آنالیز آماری داده ها نیز موید این نتایج بوده و کاهش معنی دار ( p<0/05 ) مساحت سیتوپلاسم (جدول -33) را در دوزهای 6 میکرو و میلی گرم بر میلی لیتر نسبت به گروه کنترل نشان می دهد. شکل 2-3. رنگ آمیزی فلورسنت سلول های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت با فلورسنس رنگ هوخست پس از 36 ساعت. a) کنترل b) 6 نانوگرم بر میلی لیتر c) 6 میکروگرم بر میلی لیتر d) 6 میلی گرم بر میلی لیتر (بزرگ نمایی 20X). شکل 3-3. رنگ آمیزی سلول بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت بار رنگ فلورسنس آکریدین اورنژ پس از 36 ساعت تیمار با دوزهای (b) 6 نانو، (c) 6 میکرو و (d) 6 میلی گرم بر میل لیتر اسید بوریک در مقایسه با گروه کنترول (a) (بزرگ نمایی 20X).
جدول3-3 مقایسه میانگین قطر هسته و مساحت سیتوپلاسم سلو لهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت پس از 36 ساعت تیمار با دوزهای 6 نانو، میکرو و میلی گرم بر میلی لیتر اسید بوریک.

زمان (36 ساعت)
دوز
میانگین قطر هسته
(µm)
میانگین مساحت سیتوپلاسم
(squm)
0
〖11/93〗^a±0/15
〖4001/83〗^a±35/52
6ng/ml
〖11/23〗^a±0/11
〖3998/56〗^a±28/40
6 µg/ml
〖9/63〗^b±0/15
〖2752/96〗^b±20/05
6 mg/ml
〖6/83〗^c±0/11
〖1550/33〗^c±12/52
مقادیر به صورت mean±SD می باشد. میانگین ها با کد حرفهای متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنی دار می باشد (p<0/05، Tukey test، one way ANOVA).
3-1-5 نتایج توانایی کلونیزایی، تعداد دوبرابر شدگی جمعیت سلول
تعداد دو برابر شدگی جمعیت (PDN) در روزهای 1، 3 و 6 روز بررسی شد، در 1 روز تنها دوز 6 میلی گرم بر میلی لیتر باعث کاهش معنی دار (p<0/05) PDN شد (جدول-3 5). در حالی که دوزها 6 نانو و میکرو گرم بر میلی لیتر تفاوت معنی داری با گروه کنترل نشان ندادند. در روز 3 نیز نتایج مشابه روز 1 مشاهده شد، و تنها دوز 6 میلی گرم بر میلی لیتر باعث کاهش معنی دار PDN در مقایسه با کنترل و گروه های تیماری دیگر شد. در صورتی که در تیمار 6 روزه، تمام دوزها باعث کاهش معنی داری (p<0/05) PDNنسبت به کنترل شد. علاوه بر این در تیمار 6 روزه کاهش PDN توسط دوزهای تیمار نسبت به یکدیگر تفاوت معنی دار نشان داد. از طرفی مشاهدات نشان داد که تیمار سلولها در مدت زمان 7 روز باعث کاهش معنی دار (p<0/05) تعداد و قطر کلونی ها نسبت به کنترل شد، بصورتی که دوز 6 میلی گرم بر میلی لیتر مانع تشکیل کلونی توسط سلولها در مدت زمان 7 روز شد لذا در نتایج هیچگونه کلونی گزارش نشده است (جدول 3-4). مشاهدات میکروسکوپی و ماکروسکوپی در شکل (3-4) نیز تایید کننده نتایج کمی موجود در رابطه با تعداد و قطر کلونیها میباشد.
شکل 3-4: تصاویر میکروسکوپی (بزرگ نمایی 20X) و ماکروسکوپی کلونی های تشکیل شده توسط سلول های بنیادی مزانشیم مغز استخوان تیمار شده با دوزهای 6 نانو، میکرو و میلی گرم بر میلی لیتر اسید بوریک پس از مدت زمان 7 روز.

جدول3-4 مقایسه میانگین تعداد و قطر کلونی های تشکیل شده توسط سلولهای مزانشیم مغز استخوان رت پس از 7روز تیمار با دوزهای 6 نانو، میکرو و میلی گرم بر میلیلیتر اسید بوریک.
زمان (7 روز)
دوز
میانگین تعداد
میانگین قطر
(میلی متر)
0
〖86/33〗^a±03/51
〖02/95〗^a±00/11
6ng/ml
〖80/67〗^b±02/30
〖01/83〗^b±00/05
6 µg/ml
〖75/66〗^c±06/50
〖01/00〗^c±00/04
6 mg/ml
〖00/00〗^d±00/00
〖00/00〗^d±00/00
مقادیر به صورت mean±SD می باشد. میانگین ها با کد حرفهای متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنی دار می باشد (p<0/05، Tukey test، one way ANOVA).
جدول 3-5 مقایسه میانگین تعداد دوبرابرشدگی جمعیت سلول های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت در روزهای 1، 3 و 6 روز پس از تیمار با اسید بوریک (6 نانو، میکرو و میلی گرم).

زمان (روز)
دوز
میانگین
logN/N0×3.31
1روز
میانگین
logN/N0×3.31
3روز
میانگین
logN/N0×3.31
6روز
0
〖02/10〗^a±0/38
〖03/31〗^a±0/047
〖03/95〗^a±0/02
6ng/ml
〖02/08〗^a±0/10
〖03/27〗^a±0/02
〖02/75〗^b±0/04
6 µg/ml
〖02/07〗^a±0/07
〖03/25〗^a±0/07
〖01/42〗^c±0/03
6 mg/ml
〖01/25〗^b±0/30
〖02/11〗^b±0/17
〖01/00〗^d±0/03
مقادیر به صورت mean±SD می باشد. میانگین ها با کد حرفهای متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنی دار می باشد (p<0/05، Tukey test، one way ANOVA).
3-1-6 اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی
3-1-6-1 فعالیت آنزیمهای آسپارتات ترانس آمیناز و آلانین ترانسآمیناز
آنالیز آماری دادههای حاصل از اندازه گیری فعالیت آنزیم آسپارتات ترانس آمیناز سلولهای تیمار شده در مقایسه با کنترل نشان داد که دوز 6 نانو، میکرو و میلیگرم بر میلیلیتر اسید بوریک منجر به کاهش معنیدار (p<0/05) فعالیت این آنزیم شد. علاوه بر این میزان کاهش فعالیت این آنزیم در تیمار 6 میلیگرم بر میلی لیتر نسبت به دوز های 6 نانو و میکروگرم بر میلی لیتر نیز معنی دار (p<0/001) بود (جدول6).
همچنین آنالیز آماری دادههای حاصل از اندازه گیری فعالیت آنزیم آلانین ترانس آمیناز سلولهای تیمارشده در مقایسه با کنترل نشان داد که دوز 6 نانو، میکرو و میلیگرم بر میلیلیتر اسید بوریک منجر به کاهش معنیدار (p<0/05) فعالیت این آنزیم شد. میزان کاهش فعالیت این آنزیم در تیمار 6 میلی گرم بر میلی لیتر نسبت به دوز های 6 نانو و میکروگرم بر میلی لیتر نیز معنی دار (p<0/001)بود (جدول6).
3-1-6-2 فعالیت آنزیم لاکتات دهیدروژناز
آنالیز آماری دادههای حاصل از اندازه گیری فعالیت آنزیم لاکتات دهیدروژناز سلولهای تیمارشده در مقایسه با کنترل نشان داد که دوز 6 نانو، میکرو و میلیگرم بر میلیلیتر اسید بوریک منجر به کاهش معنیدار (p≤0/05) محتوی آنزیم شد. علاوه بر این میزان کاهش فعالیت این آنزیم در تیمار 6 میلی گرم بر میلی لیتر نسبت به دوز های 6 نانو و میکروگرم بر میلی لیتر نیز معنی دار (p<0/001)بود (جدول6).
3-1-6-3 فعالیت آنزیم آلکالینفسفاتاز
میزان فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز در دوزهای 6 نانو و میکرو گرم بر میلی لیتر نسبت به کنترل و تیمار 6 میلی گرم افزایش معنی دار (p<0/05) نشان داد، در حالی که مشاهده شد تیمار سلولها با دوز 6 میلی گرم بر میلی لیتر تفاوت معنی داری نسبت به کنترل نداشته است ((p>0/05 (جدول 6).

جدول 3-6 مقایسه میانگین فعالیت (IU/L) آنزیم های آسپارتات ترانس آمیناز (AST)، آلانین ترانس آمیناز (ALT)، لاکتات دهیدروژناز (LDH) و آلکالین فسفاتاز (ALP) سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت پس از 36 ساعت تیمار با دوزهای 6 نانو، میکرو و میلی گرم بر میلی لیتر اسید بوریک.

آنزیم
دوز
AST
ALT
LDH
ALP
0
〖32/25〗^a±0/50
〖10/39〗^a±0/12
〖400/51〗^a±8/18
〖10/25〗^a±0/15
6ng/ml
〖28/12〗^b±0/25
〖7/33〗^b±0/05
〖350/43〗^b±3/86
〖13/85〗^b±0/12
6 µg/ml
〖27/50〗^b±0/32
〖7/34〗^b±0/01
〖351/39〗^b±4/37
〖14/15〗^b±0/05
6 mg/ml
〖16/25〗^c±0/50
〖4/12〗^c±0/06
〖310/25〗^c±5/00
〖10/03〗^a±0/07
مقادیر به صورت mean±SD می باشد. میانگین ها با کد حرفهای متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنی دار می باشد (p<0/05، Tukey test، one way ANOVA). 3-1-6-4 میزان الکترولیتها
غلظت کلسیم در دوزهای 6 نانو و میکروگرم بر میل لیتر نسبت به کنترل و دوز 6 میلی گرم بر میلی لیتر افزایش معنی دار (p<0/05) داشت، لازم بذکر است میزان کلسیم در دوزهای 6 نانو و میکرو گرم بر میلی لیتر نسبت به یکدیگر نیز دارای تفاوت معنی دار بودند (p<0/05)، در حالی که مشاهده شد تیمار سلولها با دوز 6 میلی گرم بر میلی لیتر تفاوت معنی داری نسبت به کنترل نداشته است ((p>0/05 (جدول 7). غلظت سدیم در دوز 6 نانوگرم بر میلیلیتر نسبت به کنترل و دوزهای 6 میکرو و میلیگرم بر میلیلیتر افزایش معنی دار ( (p<0/001 نشان داد اما دوز 6 میکروگرم بر میلیلیتر تفاوتی با کنترل نداشت ((p>0/05. دوز 6 میلیگرم بر میلیلیتر نسبت به کنترل و دوزهای 6 نانو و میکرو کاهش معنیدار نشان داد (p<0/05) (جدول 3-7).
تاثیر غلظتهای مختلف بور بر میزان پتاسیم در جهت مخالف تاثیر این غلظتها بر الکترولیت سدیم بود. دوز 6 نانوگرم بر میلی لیتر اسید بوریک باعث کاهش معنی دار (p<0/05) پتاسیم شد. این در حالی است که دوز 6 میلی گرم بر میلی لیتر اسید بوریک باعث افزایش معنی دار (p≤0/05) و دوز 6 میکرو گرم بر میلی لیتر هیچ تغییر معنی داری ((p>0/05 بر غلظت پتاسیم داخل سلولی نداشت (جدول 3-7).

جدول 3-7 مقایسه میانگین میزان کلسیم، سدیم و پتاسیم داخل سلولی سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت پس از 36 ساعت تیمار با دوزهای 6 نانو، میکرو و میلی گرم بر میلی لیتر اسید بوریک.
زمان (36h)
دوز
کلسیم (mg/dl)
سدیم ( µg/ml )
پتاسیم(µg/ml)
0
〖1/00〗^a±0/01
〖2/36〗^a±0/04
〖0/01〗^a±0/02
6ng/ml
〖2/03〗^b±0/05
〖3/09〗^b±0/03
〖0/002〗^b±0/03
6 µg/ml
〖3/60〗^c±0/03
〖2/35〗^a±0/07
〖0/01〗^a±0/03
6 mg/ml
〖1/03〗^a±0/01
〖1/01〗^c±0/02
〖0/02〗^c±0/01
مقادیر به صورت mean±SD می باشد. میانگین ها با کد حرفهای متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنی دار می باشد (p<0/05، Tukey test، one way ANOVA). 3-2 نتایج اثر دوزهای انتخابی اسید بوریک بر شاخص های تمایز به استئوبلاست
3-2-1 توانایی زیستی سلولها در روند تمایز روش MTT (رنگ سنجی)
آنالیز دادهها نشان داد که در 5 روز توانایی زیستی سلولها در حضور دوزهای 6 نانو و میکروگرم بر میلیلیتر تفاوت معنی دار با کنترل نداشت ((p>0/05 اما در روزهای 10، 15 و 21 روز دوز 6 میکروگرم میلیلیتر باعث کاهش معنیدار (p<0/05) توانائی حیات در مقایسه با گروه کنترل و گروه 6 نانوگرم بر میلیلیتر شد (جدول-3 8).
جدول 3-8 مقایسه میانگین توانایی زیستی سلول های استئوژزنیک تیمارشده با اسید بوریک (6 نانو و میکروگرم بر میلیلیتر) در روزهای 5، 10، 15 و 21 روز توسط تست MTT.
زمان (روز)
دوز
5
10
15
21
0
〖0/36〗^a±0/02
〖0/48〗^a±0/03
〖0/58〗^a±0/02
〖0/71〗^a±0/19
6ng/ml
〖0/37〗^a±0/04
〖0/47〗^a±0/01
〖0/57〗^a±0/01
〖0/70〗^a±0/04
6 µg/ml
〖0/36〗^a±0/01
〖0/39〗^b±0/02
〖0/45〗^b±0/01
〖0/60〗^b±0/05
مقادیر به صورت mean±SD می باشد. میانگین ها با کد حرفهای متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنی دار می باشد (p<0/05، Tukey test، one way ANOVA).
3-2-2 بررسی تغییرات مورفولوژیکی با استفاده از رنگآمیزی فلورسنت در نمونههای استئوژنیک
داده های حاصل در جداول 9 و 10 بیانگر تغییر قطر هسته و مساحت سیتوپلاسم در گروه کنترل بود که این خود نشان دهنده تاثیر تیمار استئوژنیک در طی روزهای 5، 10، 15 و 21 است که باعث تمایز تدریجی سلولها از مزانشیم به استئوبلاست شد. در تصویر 5 رنگ آمیزی فلوروسنت هوخست تغییرات مورفولوژیک در هسته شامل اندازه و جابجائی هسته از حالت مرکزی در سلولهای مزانشیم به حالت آسنتریک در سلولهای استئوبلاست بود. این در حالی است که رنگ آمیزی آکریدین اورنژ (تصویر 6-3) نیز تغییر مورفولوژیک سیتوپلاسم شامل گرد شدن تدریجی و وابسته به زمان در سلولهای استئوبلاست را نشان داد.
تیمار سلولها با دوز های 6 نانو و میکروگرم بر میلی لیتر اسید بوریک پس از 5 روز کاهش معنی داری را در قطر هسته و سیتوپلاسم گروههای تیماری نسبت به کنترل نشان نداد (p>0/05). اما در زمانهای 10، 15 و 21 روز تیمار 6 میکروگرم بر میلیلیتر نسبت به کنترل و دوز 6 نانوگرم بر میلیلیتر کاهش معنیدار (p<0/05) را در قطر هسته (جدول3-9) و مساحت سیتوپلاسم (جدول3-10) نشان داد. در این زمانها دوز 6 نانوگرم بر میلیلیتر نسبت به کنترل فاقد اثر متفاوتی بر قطر و سیتوپلاسم سلولهای تیمار بود. رنگ آمیزی فلوروسنت هوخست نشان داد که در روزهای 10، 15 و 21 تاثیر دوز 6 میکرو گرم بر میلی لیتر باعث فشردگی، تغییر شکل و شکستگی هسته بود (شکل 3-5). از طرفی نیز در زمانهای 10، 15 و 21 روز چروکیده شدن سیتوپلاسم در سلولهای تیمار شده با دوز 6 میکرو گرم بر میلی لیتر در مقایسه با کنترل و دوز 6 نانوگرم مشاهده میشود (شکل 3-6).
جدول 3-9 مقایسه میانگین قطر هسته (میکرومتر) سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت در نمونه های استئوژنیک پس از 5، 10، 15 و 21 روز تیمار با دوزهای 6 نانو و میکرو گرم بر میلی لیتر اسید بوریک.
زمان (روز)
دوز
5
10
15
21
0
〖10/00〗^a±0/20
〖8/64〗^a±0/30
〖7/93〗^a±2/10
〖7/12〗^a±0/08
6ng/ml
〖9/75〗^a±0/10
〖9/00〗^a±0/12
〖7/50〗^a±0/08
〖6/91〗^a±0/16
6 µg/ml
〖9/70〗^a±0/05
〖7/00〗^b±0/16
〖5/00〗^b±0/19
〖4/10〗^( b)±0/12
مقادیر به صورت mean±SD می باشد. میانگین ها با کد حرفهای متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنی دار می باشد (p≤0/05، Tukey test، one way ANOVA).

جدول 3-10 مقایسه میانگین مساحت سیتوپلاسم (squm) سلو لهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت در نمونه های استئوژنیک پس از 5، 10، 15 و 21 روز تیمار با دوزهای 6 نانو و میکرو گرم بر میلی لیتر اسید بوریک.
زمان(روز)
دوز
5
10
15
21
0
〖4001/25〗^a±37/90
〖3572/25〗^a±53/03
〖3297/70〗^a±25/50
〖3198/65〗^a±15/08
6ng/ml
〖3998/70〗^a±45/03
〖3570/20〗^a±65/00
〖3298/10〗^a±19/08
〖3197/55〗^a±23/16
6 µg/ml
〖3995/30〗^a±29/91
〖3208/35〗^b±38/16
〖3013/92〗^b±16/19
〖2005/98〗^b±39/12
مقادیر به صورت mean±SD می باشد. میانگین ها با کد حرفهای متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنی دار می باشد (p<0/05، Tukey test، one way ANOVA). شکل 3-5 رنگ آمیزی سلول های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت با رنگ فلورسنس هوخست. C) گروه کنترل، و گروه های تیماری 6 نانو (6ng/ml) و 6 میکرو (6µg/ml) گرم بر میلی لیتر از اسید بوریک در روزهای 5، 10، 15 و 21 روز (بزرگ نمایی 20X).
شکل 3-6. رنگ آمیزی سلول های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت با رنگ فلوروسنس آکریدین اورنژ. C) گروه کنترل، و گروه های تیماری 6 نانو (6ng/ml) و 6 میکرو (6µg/ml) گرم بر میلی لیتر از اسید بوریک در روزهای 5، 10، 15 و 21 روز (بزرگ نمایی 20X).

3-2-3 بررسی اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی سلولهای تمایز یافته
3-2-3-1 میزان معدنی شدن ماتریکس با سنجش رنگ آلیزارینرد
مقایسه میانگین داده ها در گروه کنترل نشان داد که تیمار استئوژنیک در روز 10 باعث شروع معدنی شدن سلولهای تمایز یافته شده است و معدنی شدن سلولها با افزایش زمان افزایش نشان داده است بصورتی که در روز 21 به بیشترین مقدار خود رسید (جدول 11). تیمار با دوزهای 6 نانو و میکروگرم بر میلیلیتر اسید بوریک در 5 روز نسبت به کنترل باعث شروع معدنی شدن شده است بصورتی که تفاوت معنی داری در میانگین میزان رنگ آلیزارین رد نسبت به کنترل دیده میشود (p<0/05). در تیمار 10روز هر دو تیماری نسبت به کنترل باعث افزایش معنی دار ( (p<0/001 میزان معدنی شدن ماتریکس شده است، ولی نسبت به یکدیگر تفاوتی معنی داری نشان نمیدهند. در تیمار 15 روز نسبت به کنترل تاثیر تیمار با اسید بوریک بدون تفاوت معنی دار بود ((p>0/05. این در حالی است که در 21 روز دوز 6 نانوگرم بر میلیلیتر نسبت به دوز 6 میکروگرم بر میلیلیتر و

پایان نامه
Previous Entries منبع مقاله درمورد اينكه، "، وليّ Next Entries منابع مقاله درباره 05)، ،