منابع مقاله درباره مورفولوژی، بافت استخوان، گروه کنترل

دانلود پایان نامه ارشد

حلقوی ندارد ولی دوزهای 3 تا 10 میلی مولار اسید بوریک در مدت زمان 24 تا 72 ساعت باعث کاهش معنی داری لاکتات و پیروات در سلول های جنسی و سرتولی در مقایسه با کنترل شد. علاو بر این اسید بوریک باعث کاهش معنی دار در الحاق (incorporation) باز آلی تیمین در ساختمان DNA میشود (92).

در سال 2010، هاآکی76 و همکارانش با بررسی اثر غلظتهای متفاوت اسید بوریک در زمانهای مختلف بر سلولهای پیش استئوبلاست MC3T3-E1 نشان دادند که، توانایی زیستی این سلولها در غلظت 1000 نانوگرم در کوتاه مدت (24 ساعت) کاهش داشته ولی در طولانی مدت (2، 5، 14روز) تغییری مشاهده نشد. علاوه بر آن رنگ آمیزی وون کوسا77افزایش ندولهای معدنی شده در غلظتهای 1 تا 10 نانو گرم بر میلیلیتر را نشان داد. تیمار با غلظتهای مختلف اسید بوریک تغییری در مورفولوژی سلولها بوجود نیاورد، ولی غلظت 1000 نانوگرم بر میلیلیتر در مدت زمان 8 روز باعث افزایش ژنهای کلاژن نوع1 (COL 1)، استئوپوینتین (OPN)، سیالوپروتئین استخوان (BSP) و استئوکلسین (OCN) شد در صورتی که تاثیری بر بیان ژن فاکتور استئوژنیک RunX2 نداشت در صورتی که در مدت زمان 3 روز این غلظت باعث افزایش بیان کلیه ژنها بجز کلاژن نوع 1 شد (93).

در مطالعه دیگری که توسط یینگ78 و همکاران در سال 2011 بر روی سلولهای استرومال مغز استخوان (BMSCs)79 انجام گرفت نشان داده شد که تفاوتی در میزان تکثیر این سلولها در غلظتهای 1، 10 و 100 نانوگرم در روزهای 4، 7 و 14 روز در مقایسه با کنترل وجود ندارد، ولی غلظت 1000 نانوگرم کاهش تکثیر سلول ها را به همراه داشت. سنجش آنزیمی آلکالین فسفاتاز در بررسی توان تمایزی استئوژنیک این سلولها، فعالیت بسیار بالا این آنزیم را در غلظت 10 و 100 نانوگرم را در مقایسه با کنترل نشان داد (98). همچنین نتایج بدست آمده از RT-PCR، نشان دهنده افزایش میزان سطح بیان ALP، استئوکلسین، کلاژن نوع 1 و پروتئینهای مورفوژنتیک 7 در غلظتهای 10 و 100 نانوگرم در مقایسه با گروه کنترل بود. همچنین میزان رسوب کلسیم در گروههای تیماری با غلظتهای 1 و 10 نانوگرم نیز افزایش نشان داد (94).
در سال 2014 دیمرسی80 و همکاران به بررسی تاثیر سدیم پنتابورات پنتاهیدرات (NaB) در حضور دی متیل سولفوکسید (DMSO) بر انجماد سلول های بنیادی مزانشیم دندان انسان پرداختند (95). در این تحقیق دوز 20 میکروگرم برمیلی لیتر NaB با غلظت 5% DMSO باعث افزایش حیات سلول ها و افزایش توانائی تمایز این سلولها به استئوبلاست و کاهش توانائی تمایز آنها به آدیپوسیت شد (95).

هدف مطالعه
همانطور که در مروری بر مطالعات گذشته آمده است، در سال های اخیر مطالعات متعددی بر تاثیر بور و مشتقات آن بر توانایی زیستی سلولهای مختلف انجام گرفته است. ولی در رابطه با تاثیر بور بر این سلولها برخی از نتایج متناقض است، بخصوص این تناقض در رابطه با اثر این عنصر بر سلولهای با منشاء مزانشیمی مشهود تر میباشد.
در مطالعه هاآکی و همکاران، تیمار سلولهای پیش استئوبلاست MC3T3-E1 با دوز 1000 نانوگرم بر میلی لیتر اسید بوریک در کوتاه مدت (24 ساعت) باعث کاهش معنی دار توانایی زیستی گزارش شد، در صورتی که در تیمار طولانی مدت بدون هیچ گونه اثر منفی گزارش شده است (93). این در حالی است که مطالعه یینگ و همکاران تاثیر دوز 1000 نانوگرم بر میلی لیتر اسید بوریک در طولانی مدت (4، 7 و 14 روز) را همراه با کاهش توانایی تکثیر سلولهای استرومال مغز استخوان معرفی میکند (94). علاوه بر این در نتایج اثر عنصر بور بر توانایی تمایز این سلولها نیز تفاوت مشاهده میشود، به گونه ای که در مطالعه هاآکی تیمار با دوز 1000 نانوگرم بر میلیلیتر اسید بوریک در 8 روز باعث افزایش بیان ژنهای کلاژن نوع1 (COL1)، استئوپوینتین (OPN)، سیالوپروتئین استخوان(BSP) و استئوکلسین (OCN) میشود ولی تاثیری بر بیان ژن فاکتور استئوژنیک RunX2 ندارد. در صورتی که در مدت زمان 3 روز این غلظت باعث افزایش بیان کلیه ژنها بجز کلاژن نوع 1 میشود (93). از طرفی در مطالعه یینگ این افزایش بیان فاکتورهای استئوژنیک فقط در دوزهای پایین تر (100-1 نانوگرم بر میلی لیتر) در مدت زمان 4 و 7 روز مشاهده میگردد، و دوز 1000 نانوگرم بر میلیلیتر تنها بیان کلاژن نوع 1 را در 7 روز افزایش داده و میزان فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز و بیان ژن آلکالین فسفاتاز، استئوکلسین (OCN) و پروتئین مورفوژنتیک استخوانی (BMP7) را کاهش داد (94). البته در برخی از نتایج این دو مطالعه در راستای تایید یکدیگر نیز قرار می گیرند. از جمله نتایج هم راستای این دو مطالعه می توان به تاثیر دوز 100 نانوگرم بر میلیلیتر بر میزان بیان پروتئین مورفوژنتیک استخوانی7 (BMP7) اشاره کرد که در طولانی مدت با افزایش معنی دار همراه است. از طرفی نیز در هر دو تحقیق تیمار با دوزهای 10-1 نانوگرم بر میلیلیتر اسید بوریک باعث افزایش معدنی شدن سلولها شده است. مطالعه یینگ در سال 2011 و پس از مطالعه هاآکی در سال 2010 انجام شد، پس از اعلام نتایج هاآکی بر روی سلولهای پیش استئوبلاست، یینگ و همکاران سعی کردند اثر عنصر بور بر سلولهای تمایز یافته از سلولهای مزانشیم را گزارش کنند. اگر چه در برخی از موارد نتایج مطالعه آنها هم راستا میباشد، در مواردی نیز نتایج آنها مغایر است و اثر بور بر سلامت سلولهای مزانشیم مغز استخوان قبل از تمایز بررسی نشده است. تحقیقات به مثبت بودن اثر عنصر بور بر استخوان سازی اشاره می کند ولی هنوز مشخص نیست که نیاز به این عنصر به عنوان یک ریز مغذی چگونه تعریف میشود و آیا مکانیسم خاصی در رابطه با اثر این عنصر بر استخوان سازی وجود دارد. با توجه به اهمیت سلول بنیادی مزانشیم مغز استخوان در فرایند ترمیم و باز سازی بافت استخوان که وابسته به توان تمایزی و تکثیری این سلول های پرتوان می باشد (96)، هدف از این مطالعه بررسی تاثیر دوزهای متفاوت از عنصر بور در زمانهای متفاوت بر توانایی زیستی، تکثیر، مورفولوژی و برخی خواص بیوشیمیائی سلول بنیادی مزانشیم مغز استخوان بود تا بتوان درک بهتری از اثرات مثبت یا منفی دوزهای متفاوت از این عنصر بدست آورد. از طرفی نیز فعالیت متابولیکی سلولهای مزانشیم مغز استخون تیمار شده با اسید بوریک قبل و بعد از تمایز مورد ارزیابی قرار گرفت. لذا این مطالعه در سه راستا طراحی و انجام شد که در زیر آمده است.
بررسی تاثیر دامنه گسترده ای از اسیدبوریک بر توانائی تکثیر و خود نوزائی سلولهای مزانشیم مغز استخوان در کوتاه مدت
بررسی تاثیر دوزهای نانو و میکرو گرم بر میلی لیتر اسیدبوریک بر توانائی تمایز این سلولها در زمانهای طولانی
بررسی اثر اسید بوریک بر فعالیت آنزیمهای دخیل در متابولیزم و الکترولیتهای این سلولها قبل و بعد از تمایز برای درک بهتر مکانیزم اثر اسید بوریک بر قابلیت تکثیر و تمایز سلولهای مزانشیم مغز استخوان.

فصل دوم
مواد و روشها

فصل دوم
مواد و روشها

2-1 انتخاب رت
در تحقیق حاضر از رت نر، نژاد ویستار با سن دو ماهه استفاده شد. حیوان مورد نظر از انسیتو پاستور تهیه و در خانهی حيوانات دانشگاه اراك تحت شرايط استاندارد نور، دما و تغذيه نگهداري شد.

2-2 جدا سازی وتكثير سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان
محيط كشت DMEM81 (Gibco Company) براي فرايند كشت سلول ها انتخاب و طبق دستورالعمل شركت توليد كننده تهيه شد (رجوع شود به پیوست 5-1). سپس به ترتيب زير عمل گرديد:
1- رت ها با دی اتیل اتر بی هوش و پس از جراحی استخوان ‌های ران و ساق در شرایط استریل جدا گردید.
2- بعد از جداسازی، بافت‌های پیوندی متصل به استخوان، استخوان‌ها به لوله‌ی فالکون حاوی 3 میلی لیتر محیط کشت کامل حاوی (DMEM82+ %15 FBS83) با دمای 4 درجه انتقال داده شدند. لوله‌های فالکون به آزمایشگاه کشت، زیر هود لامینار برده شد.
3- دو سر استخوان‌ها با قیچی استریل قطع شده و طی عمل شست و شو با کمک محیط کشت و به وسیله‌ی سرنگ 2 میلی لیتری، مغز استخوان خارج و به محیط کشت کامل انتقال داده شد (شکل 2-1).
4- عمل سانتریفوژ به مدت 5 دقیقه در 2500 دور (rpm) صورت گرفت.
5- سپس مایع رویی خارج و یک میلی لیتر از محیط کشت تازه و کامل به رسوب حاصل اضافه شد.
6- بعد از انجام عمل پیپتاژ به منظور هموژن نمودن مخلوط، مجموعه محیط کشت حاوی سلول به فلاسکهای T25 مخصوص کشت سلول از جنس پلی استیرن و به حجم Cm2 25 منتقل و 4 میلی لیتر محیط کشت کاملFBS) (DMEM+ %15 به آن اضافه گرديد.

شکل 2-1: انجام فلش اوت مغز استخوان
7- ظرف کشت به داخل انکوباتور با شرایط CO2 5 ٪، رطوبت 88٪ و دمای 37 در جه منتقل شد.
8- بعد از 24 ساعت محیط رویی خارج و سلول های چسبیده به کف ظرف توسط +PBS (رجوع شود به 5-3) شستشو داده شد. سپس 5 میلی لیتر محیط کشت کامل به هر فلاسک اضافه گردید و به انکوباتور منتقل شد (شکل 2-2).
9- این سلولها، کشت اولیه نامیده می شوند و محیط کشت آنها به مدت 14 روز، هر سه روز یکبار تعویض گردید.
10- هنگامیکه تعداد سلولها به حدی رسید که کف فلاسک را پر کردند، عمل پاساژ اجرا شد.
طی عمل پاساژ سلولها با استفاده از تریپسین-EDTA84 جدا و به فلاسکهای جدید منتقل شد. برای به دست آوردن خلوص 95-90 درصد سه مرحله پاساژ تکرار شد.

شکل 2-2: نحوه قرار دادن فلاسک به انکوباتور

2-2-1 اجراي پاساژ
1- در مرحله اول محیط رویی سلولها تخلیه شد.
2- سپس سلولهای کف فلاسک دوبار با محلول -PBS (رجوع شود به پیوست 5-2) شستشو داده شد.
3- به هر فلاسک نوعT25، 400 میکرولیتر محلول تریپسین- EDTA (روش جدا سازی آنزیمی) اضافه و فلاسک را به مدت 2-1 دقیقه، در انکوباتور 37 درجه قرار دادیم.
4- فلاسک از انکوباتور خارج و با کمک کف دست به آهستگی (روش مکانیکی) ضرباتی به کناره فلاسک وارد شد؛ تا زمانیکه تمام سلولها از کف فلاسک جدا شوند.
5- محلول تریپسین- EDTAبا اضافه کردن 2 میلی لیتر محیط کشت کامل خنثی شد.
6- با استفاده از پیپت و عمل پیپتاژ سلولها کاملا از کف فلاسک شسته و جدا شدند؛ سپس به لولهی فالکون 15 میلی لیتری انتقال یافت.
7- سلولها با 2500 دور (rpm)و به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شدند.
8- بعد از تعویض مایع رویی در هر لوله فالکون عمل پیپتاژ صورت گرفت.
9- شمارش سلولها با استفاده از لام نئوبار انجام شد (شکل 2-3).

شکل 2-3: لام نئوبار (www.azmiran.com).
10- سلولها به طور مساوی بین دو فلاسک تقسیم و به هرفلاسك 4 ميلي ليترمحيط كشت تازه كامل اضافه شد.
11-بعد از طي سه پاساژ به منظور خالصسازي، از سلولها براي انجام مراحل بعد استفاده شد.
تست هایی که در ادامه به توضیح آنها پرداخته خواهد شد در دو فاز غیرتمایزی و تمایزی انجام شد.

2-3 اثبات مزانشیم بودن سلول های استخراج شده:
اغلب سلولهای بنیادی مزانشیم به وسیلهی روشی مشابه که به طور اولیه توسط Friedenstein مورد استفاده قرار گرفت، ایزوله میشود و این روش از شاخصه فیزیکی چسبیدگی به سطوح پلاستیک استفاده میکند. هر چند، ماکروفاژها، سلولهای اندوتلیال، لنفوسیتها و سلولهای عضلانی صاف نیز به این سطح میچسبند ولی سلولهای مزانشیم پاساژهای بیشتری را نسبت به فیبروبلاستها تحمل میکنند و همچنین به دلیل رشد سریعتر، می توان آنها را به کمک پاساژهای مکرر غنیسازی نمود (97).
2-3-1 تمایز به استخوان
سلولهای پاساژ سوم مورد شمارش قرار گرفت و تعداد 105×1 سلول به ازای هر خانه یک پلیت 6 خانه ای کشت شد.
بعد از 4 روز که سلول ها 90-80 درصد کف چاهک ها را پر کرد، محیط کشت سلول ها خارج شد و محیط تمایزی (رجوع شود به 5-4) به آن ها اضافه و محیط هر 4-3 روز یکبار تا 21 روز تعویض شد. سپس تمایز استئوژنیک، توسط بررسی ماتریکس معدنی با استفاده از رنگ آمیزی آلیزارین رد ارزیابی شد.
مراحل رنگ آميزي آليزارين رد s85
1- تك لايه سلولي تشكيل شده در كف پليت 6 خانه‌ای دو بار با محلول -PBS شسته شد.
2- سلول‌ها‌ به مدت 15-10 دقيقه با فرمالدهيد 10٪ در دماي

پایان نامه
Previous Entries منبع پایان نامه با موضوع میزان استفاده، ظرفیت حرارتی، هم افزایی Next Entries منبع پایان نامه با موضوع ، NX)=-(1+A(NX))،