منابع تحقیق درباره نمونه برداری، آلودگی هوا، پیوند دوگانه

دانلود پایان نامه ارشد

درون زوگ ها ریخته شد هر یک از زوگ ها توسط یک عدد لوله شیشه ای متصل به لوله های هوادهی که به پمپ مرکزی وصل بود هوادهی شدند تا سطح اکسیژن در حدود 6-5 میلی گرم در لیتر (ppm 6-5) باقی بماند. برای ممانعت از تبخیر آب و جلوگیری از ورود آلودگی هوای بیرون درب آن ها محکم بسته شد. بعد از انجام این مراحل، میزان ناپلی مورد نیاز و شسته شده به همراه یک لیتر دیگر آب شور به درون زوگ ها افزده شد تا حجم آب درون زوگ ها به 6 لیتر برسد و طی این کار هوادهی نیز تداوم داشت. با توجه به اینکه در این تحقیق سه تراکم ناپلی و سه غلظت روغن کلزا برای غنی سازی مورد نظر بود لذا غنی سازی هر کدام از گونه ها جداگانه (در روز های متفاوتی) صورت گرفت.

3-4- تخم گشايي37 سيست آرتميا
شرایط لازم برای تخم گشایی (تفریخ) سیست آرتمیا عبارتند از:
– آب دریا با شوری ppt 35-33
– دمای آب 28-26 درجه سانتیگراد
– pH آب حدود 5/8-8
– نور 2000 لوکس
– اکسیژن در حدود ppm 5-2 (Sorgeloos, 1980)
دمای آب درون آکواریوم به وسیله دو بخاری آکواریومی تا 28 درجه سانتیگراد تنظیم شد (دمای آب درون زوگ ها نیز 28 درجه سانتیگراد بود) و نور نیز توسط چهار عدد مهتابی تامین شد و عمل هوادهی به کمک لوله پلاستیکی و شیلنگ هوادهی انجام شد (هوادهی در حدی بود که سیست ها به حالت معلق درآیند) که در فاصله بین لوله پلاستیکی و شیلنگ هوادهی فیلتر سر سرنگی 45/0 میکرونی (به منظور جلوگیری از ورود آلودگی هوا به درون زوگ ها) قرار گرفت. به منظور تهیه آب با شوری ppt 35، آب دریاچه ارومیه اتوکلاو شده با آب مقطر مخلوط و شوری آن با شوری سنج38 تنظیم شد. بعد از فیلتر کردن با صافی 100 میکرونی زوگ های شیشه ای تمیز به حجم شش لیتر با این آب شور پر شدند. بعد از برقراری شرایط فوق، سيست هاي ضدعفونی شده به داخل زوگ ها منتقل شدند و تخم گشایی با هوادهی شدید انجام پذيرفت. سیست های آرتمیا فرانسیسکانا و آرتمیا ارومیانا به ترتیب بعد از 21 و 24 ساعت تفریخ شدند.

شکل 3-1. تخم گشایی سیست آرتمیا در زوگ های 7 لیتری.

3-5- جداسازی و شمارش لارو ها
برای جداسازی لارو ها از پوسته سیست ها و مواد زائد دیگر از ویژگی نورگرایی مثبت لاروهای آرتمیا استفاده شد. به این ترتیب که ابتدا محتویات درون زوگ ها بعد از قطع هوادهی درونشان (به مدت 15-10 دقیقه) با استفاده از شیلنگ به داخل آکواریوم شیشه ای منتقل شد (البته باید در این مدت بخاری آکواریوم خاموش شود). سپس با قرار دادن یونولیت زیر آکواریوم، به حالت شیب دار درآمد (تا لاروهای فعال به بالای شیب بروند و لاروهای ضعیف که درصد بقای پایینی دارند جدا و حذف گردند). هوادهی داخل آکواریوم قطع شد تا همه ناپلیوس ها به حالت معلق در نیایند. سپس تمام لامپ های محوطه خاموش و فقط به قسمت شیب دار آکواریوم نور تابانیده شد تا با خاصیت نورگرایی مثبت ناپلیوس های فعال در آن قسمت جمع شوند. سپس با استفاده از لوله پلاستیکی متصل به لوله شیشه ای ناپلیوس ها جمع شدند، بدین صورت که ابتدا درون لوله شیشه ای و پلاستیکی با آب پر شده، سپس طرف لوله شیشه ای وارد قسمت بالای شیب آکواریوم گردید و آکواریوم دیگری در ارتفاع پایین تر از این آکواریوم گذاشته شد که داخل آن پیپت های متصل به لوله های هوادهی به منظور هوادهی تعبیه شده بود. ناپليوس هاي تازه تخم گشايي و ضدعفوني شده با استفاده از رفتار نورگرايي مثبت، از سيست هاي تخم گشايي نشده و پوسته ها جدا و به درون آکواریوم منتقل گردیدند. بعد از جمع آوری کل ناپلیوس ها، پوسته های خالی و احیاناً سیست های دکپسوله شده و جنین باقی مانده درون آکواریوم شیشه ای دور ریخته شدند.
بعد از آن با استفاده از سمپلر µl 250 از نواحی مختلف آکواریوم 10 نمونه برداشته و به درون خانه های میکروپلیت انتقال داده شدند. بعد از ریختن یک قطره لوگل در هر خانه حاوی نمونه ناپلیوس، تعداد ناپلیوس ها زیر میکروسکوپ شمارش شدند. از مجموع 10 خانه شمرده شده میانگین گرفته و تعداد ناپلیوس های آکواریوم در یک میلی لیتر محاسبه شد. با توجه به اینکه در این تحقیق از تراکم های 50000، 100000 و 200000 آرتمیا ارومیانا و آرتمیا فرانسیسکانا در لیتر آب شور استفاده شد، بنابراین میزان مورد نیاز از آب شور دارای ناپلیوس محاسبه و در درون صافی 150 میکرونی با آب مقطر شستشو داده شد. در نهایت، ناپلیوس ها به درون زوگ های تمیز حاوی آب تازه با شوری ppt 35 به حجم 6 لیتر با هوادهی مناسب منتقل شدند.

شکل 3-2. جداسازی ناپلیوس ها از سیست ها و پوسته ها.

3-6- غنی سازی ناپلیوس ها
در این بخش عمل غنی سازی ناپلیوس ها با روغن کلزای بومی تحت تراکم ها و غلظت های مختلف روغن در پنج زمان نمونه برداری مورد بررسی قرار گرفته است.

شکل 3-3. غنی سازی ناپلیوس ها با استفاده از امولسیون.

3-7- تهيه محلول غنی سازی
براي تهيه سوسپانسيون ابتدا به نسبت 1/0 :10 آب با دمای 40 درجه سانتیگراد و لسیتین درون بشر خشک و تمیز ریخته و با استفاده از همزن برقی به خوبی مخلوط شدند تا حدی که دیگر اثری از لسیتین قهوه ای رنگ در درون بشر دیده نشود و محلول به رنگ شیری درآید. سپس روغن به نسبت 1 به این محلول اضافه شد و با استفاده از همزن به خوبی مخلوط شد. بعد از آن مقداری از نمونه روی لام ریخته شد و یک عدد لامل روی آن جهت بررسی قطر ذرات زیر میکروسکوپ گذاشته شد. هر چقدر روش آماده سازی محلول دقیق تر و بهتر باشد و اندازه میکروگلبول های تهیه شده مناسب باشد میزان غنی سازی بهتر بوده و ارزش غذایی ناپلیوس به ویژه از نظر دو اسیدچرب غیراشباع زنجیره بلند (DHA و EPA) افزایش می یابد. درنهایت محلول آماده شده به درون ارلن تمیز و اتوکلاو شده منتقل شد و پس از تزریق گاز ازت (نیتروژن) برای جلوگیری از اکسید شدن اسیدهای چرب، درب ارلن با پارافیلم پوشانده و تا موقع استفاده داخل یخچال نگهداری شد.
میزان اسیدهای چرب اشباع (SFA) روغن کلزا طبق برچسب کارخانه ( شرکت فرآورده های روغنی Sirco)، 8-6% و اسیدهای چرب غیراشباع با یک پیوند دوگانه MUFA 69-56% و اسیدهای چرب غیراشباع با چند پیوند دوگانه PUFA 33-25% بود.
زوگ های غنی سازی که قبلاً برای تراکم ها و غلظت های مختلف آماده شده بودند، بعد از ریختن ناپلیوس ها درونشان با توجه به اینکه نسبت لسیتین، روغن و آب 1/0، 1 و 10 بود به ازای هر لیتر برای غلظت های 1/0، 2/0 و 3/0 گرم در لیتر به ترتیب 1، 2 و 3 میلی لیتر از محلول به وسیله پیپت مدرج به درون زوگ ها ریخته شد (البته ابتدا محلول داخل بشر ریخته شد و با همزن کمی مخلوط گردید تا برای غنی سازی مورد استفاده قرار گیرد) و باقیمانده امولسیون تهیه شده مجدداً بعد از فلاش کردن (تزریق) گاز نیتروژن و بستن درب ارلن با پارافیلم درون یخچال برگردانده شد، دومین دوره غنی سازی نیز 12 ساعت بعد انجام گرفت (میزان محلول غنی سازی با توجه حجم آب باقیمانده درون زوگ ها محاسبه شد). مسئله مهم در دومین دوره غنی سازی، افت pH به دلیل افزودن محلول امولسیون و استفاده از این محلول توسط ناپلیوس هاست که برای رفع این مشکل از محلول ضعیف قلیایی استفاده شد (حدود 5/0 گرم NaCO3 در درون بالن ژوژه ریخته، در50 سی سی آب مقطر حل گردید و محلول ضعیف NaCO3 تهیه شد). البته لازم به ذکر است که میزان pH در ساعت های 3، 6، 9، 12، 15 و 18 ساعت بعد از غنی سازی اندازه گیری شد و در مواقعی که pH پایین تر از 5/8، می شد این محلول مورد استفاده قرار می گرفت، زیرا درصد بقا با کاهش pH و افزایش متابولیت ها کاهش می یابد.

3-8- نمونه برداری برای محاسبه میزان بقا39 و طول کل40
از هر زوگ به تعداد 10 نمونه 250 میکرولیتری در زمان های 6، 9، 12، 15 و 18 ساعت برداشته و به داخل میکروپلیت های 24 خانه منتقل شد. در ابتدا تعداد ناپلیوس های مرده (تلفات) بررسی و بعد از شمارش مرده ها با ریختن یک قطره لوگل بر روی نمونه ها تمامی ناپلیوس ها کشته شده و تعداد کل ناپلیوس ها نیز شمارش شد. سپس از میزان تلفات و نیز تعداد کل ناپلیوس ها در 10 نمونه میانگین گرفته شد و بدین ترتیب درصد تلفات و تعداد کل ناپلیوس ها بعد از غنی سازی و درصد بقای آن ها با استفاده از فرمول زیر در زمان مورد نظر محاسبه شد (این کار برای تمامی زوگ ها در تیمارها و تکرارهای مختلف انجام شد).
+ (حجم آب باقیمانده درون زوگ × تعداد ناپلی زنده در یک لیتر))] = درصد بقا
100× [تعداد کل ناپلی درون زوگ / (تعداد ناپلی برداشت شده برای آنالیز اسیدهای چرب

شکل 3-4. شمارش ناپلیوس ها به منظور محاسبه درصد بقا.

جهت رسم طول ناپلیوس از هر زوگ به تعداد 20 عدد ناپلی زنده تهیه و با استفاده از لوگل تثبیت گردیدند. سپس روی لام کنار هم چیده شده و طول کل آنها با استریومیکروسکوپ مجهز به لوله رسم ترسیم گردید. درنهایت خطوط رسم شده توسط دستگاه Digitizer اندازه گیری و توسط برنامه نرم افزاری مربوطه به داده های عددی بر حسب میلی متر تبدیل گردیدند.

شکل 3-5. کشیدن طول کل ناپلیوس ها با استریومیکروسکوپ.

3-9- نمونه برداری برای تعیین میزان اسیدهای چرب
در پنج زمان مورد نظر از هر زوگ به میزان 5/0 گرم ناپلی (معادل 50000 ناپلی) روی صافی 80 میکرونی منتقل و بعد از شستشو با آب شیر و آبگیری آنها توسط دستمال کاغذی از زیر صافی ، ناپلیوس ها با اسپاتول41 برداشته و به درون میکروتیوب منتقل شدند و پس از درج مشخصات نمونه، تاریخ و ساعت تا زمان آنالیز در درون فریزر 80- درجه سانتیگراد نگهداری شدند. برای تعیین پروفیل و میزان اسیدهای چرب، متیل استرهای اسیدهای چرب با استفاده از روش متیل استریفیکاسیون مستقیم (Lepage and Roy, 1984)، استخراج شدند.

شکل 3-6. نمونه برداری ناپلی برای اندازه گیری میزان اسیدهای چرب.

3-10- استخراج اسیدچرب
جهت بررسی اسید های چرب ابتدا 5/0 گرم از نمونه تر وزن و درون لوله های شیشه ای درب دار مخصوص ریخته شد. به هر کدام از لوله ها ml 5 محلول متانول/تولوئن (v/v 3:2 ) و ml5 محلول تازه تهیه شده استیلکلراید/ متانول (v/v 1:20) به عنوان عامل استریفیکاسیون اضافه شد. درب ظروف محکم بسته و در حمام آبی°c 100 به مدت یک ساعت جوشانده شد. لوله ها هر 10 دقیقه یکبار تکان داده شدند و درب لوله ها کنترل گردید (برای جلوگیری از پریدن حلال ها). بعد از اینکه لولهها سرد شدند محتوای لوله ها به درون فالکون های ml 50 انتقال داده و به هر یک ml5 آب دیونیزه و ml5 هگزان اضافه شد. سپس لوله ها به مدت 5 دقیقه با دور rpm3000 سانتریفیوژ شدند و فاز بالایی محلول به وسیله پیپت پاستور به درون فالکون های تمیز ml 15 منتقل گردید و این عمل دو بار دیگر با افزودن ml 3 هگزان تکرار شد. سپس فالکون های ml 15 به مدت 5 دقیقه با دور rpm 10000 سانتریفیوژ شدند تا آلودگی باقیمانده در ته فالکون جمع شود. محلول رویی درون فالکون ها به لوله های آزمایش منتقل و از طریق فیلتر سولفات سدیم بدون آب، آبگیری و به بالن های گلابی شکل انتقال داده شد. بالن ها توسط روتاری در دمای ˚c35 تغلیظ و حلال ها تبخیر شدند. سپس lµ 500 ایزواکتان به عنوان حلال متیل استر و رقیق کننده داخل هر یک از بالن ها ریخته شد. درنهایت اسیدهای چرب استخراج شده توسط پیپت پاستور به درون میکروتیوب های ml 5/1 منتقل و تا زمان تزریق به دستگاه کروماتوگرافی گازی در فریزر نگهداری شدند. پس‌ از تهيه‌ محلول‌ نهايي‌ مقدار 1 ميكروليتر از آن به‌ دستگاه‌ كروماتوگرافی‌ گازی تزريق‌ گردید‌.
نمونه ها به دستگاه کروماتوگرافی گازی (مدلAgilent technologies 7890A، ساخت آمریکا) تزریق شدند. آشکارساز این دستگاه از نوع یونیزاسیون شعله ای (FID)42 است که شعله آن از سوختن گاز هیدروژن با هوا تامین می گردد و از گاز نیتروژن به عنوان گاز حامل در این دستگاه استفاده می شود.

پایان نامه
Previous Entries دانلود پایان نامه با موضوع نقطه تقاطع Next Entries دانلود پایان نامه با موضوع روش حداقل مربعات، مدل دینامیکی، دینامیکی