دانلود پایان نامه درمورد نمونه برداری

دانلود پایان نامه ارشد

لوله هاي فالكون 50 ميلي ليتري تميز منتقل شدند. عمل سانتريفيوژ كردن پس از افزودن 3 ميلي ليتر هگزان روي نمونه ها، دو بار ديگر نيز تكرار شد تا از انتقال كل اسيدهاي چرب به همراه هگزان به لوله هاي جديد اطمينان حاصل شود .محتويات لوله ها از فيلتر سولفات سديم عبور داده و به ظروف گلابي شكل از پيش وزن شده منتقل شدند. سپس، بخش حلّال به كمك دستگاه تقطير در خلاء مدل LABOROTA4003 ساخت شركت Heidolph آلمان در دماي 35 درجه سانتي گراد و با تزريق گاز نيتروژن، جدا شد و ظروف ها مجدداً وزن شد. به اين ترتيب، مقدار كل متيل استرهاي اسيدهاي چرب استخراج شده از هر نمونه، مشخص گرديد.
و) در مرحله بعد داخل هر يك از ظروف حاوي متيل استرها، 5/0 ميلي ليتر ايزواكتان افزوده و تركيب حاصل به ظروف كوچك 2 ميلي ليتري منتقل و پس از تزريق گاز نيتروژن در ظروف مذكور، نمونه ها تا زمان آناليز در فريزر (C °30- ) قرار داده شد . نمونه ها در اولين فرصت از فريزر خارج و جهت تزريق به دستگاه كروماتوگرافي گازي آماده شد. براي اين منظور، نمونه ها طوري با ايزواكتان رقيق شدند كه در هر ميلي ليتر محلول نهايي 2 ميلي گرم متيل استر وجود داشته باشد. پس از تهيه محلول نهايي، مقدار 4/0 ميكروليتر از آن به دستگاه كروماتوگرافي تزريق شد.
ی) در نهايت مقدار اسيدهاي چرب هر نمونه، با مقايسه طول منحني هاي هر اسيد چرب با طول منحني استاندارد داخلي، محاسبه گرديد. درصد هر اسيد چرب نيز نسبت به طول كل اسيدهاي چرب تعيين شد (Lepage and Roy, 1984)

1-4-5-2- اساس كروماتوگرافي گازي براي آناليز اسيدهاي چرب
اساس اين روش، جداسازي فيزيكي يك ماده (فاز) متحرك، به وسيله جذب آن در يك ماده (فاز) ثابت است. فاز ثابت معمولاً حاوي ماده جامد بي اثري مانند ژل سيليكا يا گرانول هاي آجر نسوز كه با مايع غير فراري پوشانده شده اند، مي باشد. اين فاز ثابت در لوله (ستون) هاي موئينه از جنس شيشه يا فلز قرار داده شده است و مخلوطي از استرهاي اسيدهاي چرب در يك انتهاي ستون به حالت بخار درمي آيد. تمام طول ستون در حرارت ‍C° 230-100 قرار مي گيرد. جريان ثابتي از يك گاز بي اثر، ازت استر اسيدهاي چرب را درون ستون با خود حمل مي كند. همانند ساير روش هاي كروماتوگرافي، جداسازي بخار استر اسيدهاي چرب بستگي به تفاوت ميل تركيبي اجزاء تشكيل دهنده اين بخارات، نسبت به فاز جامد دارد. گازهايي كه به شدت به فاز جامد جذب مي شوند، با سرعت كمتري از ستون مي گذرند و ديرتر از آن خارج مي شوند. به محض خروج استرهاي يك اسيد چرب از ستون، اين استرها با آشكارسازهاي فيزيكي يا شيميايي رديابي مي شوند و به طور خودكار در فواصل زماني مختلف ، و براساس مدت زمان توقف استرها در ستون ها يا فاز ثابت ، يك سري منحني به دست مي آيد. سطوح زير منحني ها نشانگر غلظت اسيد چرب مربوطه است و تشخيص هر يك از اجزاء، با مقايسه منحني هاي به دست آمده از محلول استاندارد امكان پذير است (پيترا و همكاران، 1990).

2-4-5-2- برنامه دمايي
دماي تزريق روي 250 درجه سانتي گراد و دماي آشكار ساز FID روي 260 درجه سانتي گراد تنظيم شدند. دماي اوون از 100 درجه سانتي گراد شروع شد و پس از 2 دقيقه توقف در اين دما، با سرعت 30 درجه سانتي گراد در دقيقه افزايش يافت و به دماي 182 درجه سانتي گراد رسيد. بعد از 5 دقيقه توقف در اين دما، با سرعت 2 درجه سانتي گراد در دقيقه به دماي 220 رسيد و پس از 3 دقيقه توقف در اين دما با سرعت 3 درجه در دقيقه به دماي 230 درجه رسيده و دراين دما به مدت 3 دقيقه تا پايان آناليز باقي مي ماند. كل مراحل 40 دقيقه به طول مي انجاميد.

6-2- محاسبه هضم پذیری ظاهری:
1-6-2- تهیه غذا و نمونه مدفوع ماهیان :
برای محاسبه هضم پذیری ظاهری از ماکر غیر قابل هضم یتریدیوم اکساید Y2O3 محصول شرکت سیگما با درجه خلوص 9/99% استفاده گردید. که به هنگام غذاسازی به میزان 1/0 درصد در جیره آزمایشی ماهیان مورد استفاده قرار گرفت. غذای حاوی مارکر غیر قابل هضم در 10 روز پایانی دوره پرورشی استفاده شد. و ماهیان پس از 10 روز تغذیه با غذای مارکر دار اقدام به جمع آوری مدفوع از ماهیان شد. به این منظور تعداد 10 عدد ماهی از هر تکرار انتخاب و پس از بیهوشی در عصاره گل میخک اقدام به جمع آوری مدفوع از قسمت انتهایی روده (2 سانتیمتری انتهایی روده) شد. به این صورت که قسمت انتهایی روده ماهیان را با قیچی بصورت طولی برش داده و سپس با تیغ جراحی محتویات روده را به آرامی جمع آوری شد. و نمونه ها تا زمان انجام آزمایش در فریزر 20- نگهداری شدند (Austreng, 1978).

2-6-2- تعیین میزان مارکر مدفوع و غذا:
ابتدا نمونه های مدفوع جمع آوری شده را با دستگاه فریز درایر مدل (مدل دستگاه) خشک کرده و سپس میزان 5/0 گرم نمونه را با ترازو داخل بوته چینی وزن میکنیم. و سپس نمونه ها را به مدت 6 ساعت در داخل کوره با حرارت 550 درجه سانتیگراد میسوزانیم. به بوته های چینی پس از سرد شدن 5 میلی لیتر محلول HCL:HNO3 با نسبت 2:1 اضافه میکنیم و سپس میجوشانیم تا بیرنگ شود. پس از سرد شدن 3-2 قطره آب اضافه میکنیم و سپس 25/1 میلی لیتر HNO3 اضافه کرده محلول حاصله را با آب مقطر به حجم 25 میلی لیتر می رسانیم. و سپس با دستگاه ICAP-spectrometry تعیین غلظت می نماییم. بدلیل نبود این دستگاه در استان این بخش از کار توسط شرکت آریا شیمی شریف در تهران انجام پذیرفت (2000Storebakken, ).

3-6-2- محاسبه هضم پذیری ظاهری پروتئین و چربی:
میزان 5/0 گرم نمونه مدفوع برای محاسبه پروتئین و 1 گرم نمونه از هر تکرار برای محاسبه چربی وزن شد. برای محاسبه پروتئین از روش کلدال و برای محاسبه چربی با روش استخراج با حلال اتر استفاده گردید.
برای محاسبه میزان هضم پذیری چربی و پروتئین از فرمول زیر استفاده می گردد:

هضم پذیری ظاهری چربی%: 100_ (100×(مارکر غذا ×مارکر مدفوع)×(میزان چربی غذا× میزان چربی مدفوع) _ 1)

هضم پذیری ظاهری پروتئین %:100_ (100×(مارکر غذا ×مارکر مدفوع)×(میزان پروتئین غذا× میزان پروتئین مدفوع) _ 1)

7-2- سنجش فعالیت های آنزیمی
جهت بررسی فعالیت آنزیمهای گوارشی، نمونه برداری در روزهای صفر، 30 و 61 صورت پذیرفت. عمل غذا دهی ماهیان 24 ساعت قبل از انجام نمونه برداری قطع شد .از هر تانک سه ماهی بصورت کاملا تصادفی انتخاب و بعد از بیهوشی با پودر گل میخک و ثبت طول و اندازه (به ترتیب تا 1/0 سانتیمتر و 1/0 گرم) با ضربه ای به سر کشته شدند. زواید پیلوریک ماهیان بعد از جدا کردن چربیهای زاید اطراف (تمامی مراحل در روی یخ انجام می پذیرفت) و توزین و کد گذاری درون میکروتیوپ به داخل فریزر 70- منتقل شدند.
1-7-2- تهيه عصاره آنزيمي
براي سنجش آنزيم هاي زوائد پیلوریک (پروتئاز کل، آميلاز و ليپاز)، يك گرم بافت زواید پیلوریک در 9 ميلي ليتر بافر Tris-HCl 100 ميلي مولار، EDTA 1/0 ميلي مولار، X-100Triton 1/0 درصد در 8/7pH توسط هموژنايزر (مدل D 500) هموژن شده و سپس هموژنات به مدت 30 ثانيه در سانتريفوژ يخچالدار (مدل Z36HK) در 4 درجه سانتيگراد و 30000 g سانتريفوژ گرديد و سوپرناتانت حاصله در ويال اپندورف تقسيم شده و تا زمان سنجش در دماي 80- درجه سانتيگراد نگهداري شد (Chong و همكاران، 2002).
2-7-2- سنجش غلظت پروتئين محلول
پروتئين محلول نمونه هاي هموژن شده ماهیان قزل آلا به روش Bradford (1976) سنجيده شد. جهت اين منظور از آلبومين سرم گاوي (BSA) استفاده گرديد. به منظور تهيه محلول برادفورد ابتدا 100 ميلي گرم ماده شيميايي کوماسي بلو را در 50 ميلي ليتر الکل اتانول 95% و 100 ميلي ليتر اسيد فسفريک 85% حل نموده و سپس حجم محلول بدست آمده با بکارگيري آب دوبار تقطير به حجم 1000 ميلي ليتر رسانده شد.اين محلول توسط کاغذ فيلتر واتمن نمره 1، فيلتر شده و دور از نور تا زمان سنجش آنزيمي در يخچال نگهداري گرديد.
جهت سنجش پروتئين محلول ابتدا منحني استاندارد تهيه گرديد. جهت ترسيم اين منحني توسط دستگاه اسپکتروفتومتر، ابتدا محلول اوليه BSA با غلظت µg/ml 100 تهيه شد و سپس محلول هايي با غلظت هاي متفاوت BSA (0، 20، 40، 60، 80 و 100 µg/ml) تهيه گرديد(جدول 4-2).
جدول 4-2- غلظت هاي مختلف آلبومين سرم گاوي
غلظت هاي متفاوت BSA(µg/ml)
0
20
40
60
80
100
بافر فسفات 1/0 مولار (µL)
100
80
60
40
20
0
آلبومين سرم گاوي (µL)
0
20
40
60
80
100

هر يک از غلظت ها با 3 تکرار تهيه شد و در نهايت يک ميلي ليتر معرف برادفورد به هر کدام افزوده شد سرانجام اين محلول با طول موج 595 نانومتر قرائت گرديده و منحني استاندارد رسم گرديد.

نمودار1-2- منحني استاندار BSA. محور X: غلظت پروتئين (µg/ml)، محور Y: جذب نوري (optical absorption)
اندازه گيري پروتئين محلول عصاره آنزيمي در 3 تکرار انجام شد. 20 ميکروليتر از عصاره آنزيمي پس از انجمادزدايي، توسط 80 ميکروليتر بافر فسفات به حجم 100 ميکروليتر رسيد، سپس از محلول رقيق شده 10 ميکروليتر برداشته و با 90 ميکروليتر بافر فسفات به حجم 100 ميکروليتر رسانده شد. همزمان محلول شاهد که شامل 100 ميکروليتر بافر فسفات است نيز آماده شد و بعد از افزودن محلول برادفورد جذب در 595 نانومتر قرائت گرديد. سپس قرائت نوري بدست آمده از نمونه ها به منحني استاندار BSA منتقل شد و ميزان پروتئين محلول محاسبه شد.
3-7-2- سنجش فعاليت آنزيم آلفا- آميلاز
براي تعيين فعاليت آلفا- آميلاز از نشاسته به عنوان سوبسترا استفاده گرديد. نشاسته تحت اثر آنزيم تجزيه شده و توليد مالتوز مي نمايد كه از طريق رنگ سنجي و تغيير شدت رنگ در معرف دي نيترو ساليسيليك اسيد قابل سنجش مي باشد.
معرف ها:
1- بافر فسفات سديم 02/0 مولار حاوي كلريد سديم 006/0 مولار، 9/6pH.
2- هيدروكسيد سديم 2 نرمال
3- معرف رنگي دي نيتروساليسيليك اسيد
براي تهيه اين معرف ابتدا 1 گرم از ماده 5،3 – دي نيتروساليسيليك اسيد در 50 ميلي ليتر آب مقطر حل شد. سپس 30 گرم نمك راشل به آرامي به محلول اضافه شد. 20 ميلي ليتر هيدروكسي سديم 2 نرمال به محلول اضافه شد كه در اين حالت رنگ محلول به رنگ قهوه اي روشن در مي آيد. بعد حجم آن با مقطر تا 100 ميلي ليتر رسانده مي شود. اين محلول بايستي در شيشه كدر و دور از نور نگهداري شود. مدت نگهداري اين معرف نبايد بيش از 2 هفته طول بكشد.
1- نشاسته 1 درصد
براي تهيه نشاسته 1 درصد، 1 گرم نشاسته در 100 ميلي ليتر بافر فسفات سديم 02/0 مولار حاوي كلريد سديم 006/0 مولار، 9/6 pH مخلوط شده و سپس به آرامي به حالت جوش رساندهتا نشاسته بخوبي در بافر حل شود. بعد آن را خنك كرده و در صورت لزوم حجم آن با آب مقطر تا 100 ميلي ليتر رسانده مي شود.
4- محلول ذخيره مالتوز
180 ميلي گرم مالتوز در 100 ميلي ليتر آب مقطر حل مي شود. اين محلول ذخيره حاوي5 mole/ml/ مالتوز مي باشد.
روش كار :
الف- رسم منحني استاندارد مالتوز
ابتدا با استفاده از محلول ذخيره مالتوز يك منحني استاندارد تهيه شد. بدين صورت كه 5 لوله آزمايش برداشته و رقت هايي بين mole/ml 5-3/0 را با استفاده از محلول ذخيره مالتوز در هر يك آماده شد. رقت هاي انتخابي در اين آزمايش، 3/0، 6/0، 2/1، 5/2 و 5 ميكرو مول مالتوز در ميلي ليتر بودند. مثلا براي بدست آوردن رقت 3/0 ابتدا 60 ميكروليتر از محلول ذخيره مالتوز را به يك لوله آزمايش با پيپت وارد كرده و سپس تا حجم 1 ميلي ليتر با آب مقطر رقيق رقيق شد. بعد ميزان 5/0 ميلي ليتر از هر رقت را در لوله هاي آزمايش ديگري با پيپت وارد كرده و يك لوله آزمايش ديگر نيز به عنوانشاهد كه محتوي 5/0 ميلي ليتر آب مقطر است در نظر گرفته شد. بعد به تمام لوله ها (استاندارد و شاهد) 5/0 ميلي ليتر از معرف دي نيتروساليسيليك اسيد اضافه كرده و تمام لوله ها به مدت 5 دقيقه در حمام آب جوش قرار گرفتند. بعد از 5 دقيقه لوله ها از حمام خارج شد و در دماي اتاق خنك شدند. در اين حالت رنگ ايجاد شده به غلظت مالتوز بستگي داشته و هر چه غلظت مالتوز بالاتر باشد رنگ محلول تيره تر خواهد

پایان نامه
Previous Entries دانلود پایان نامه درمورد ارزش تولید، ویتامین E Next Entries دانلود پایان نامه درمورد ميزان، ميلي، دقيقه