دانلود پایان نامه درمورد ميزان، ميلي، دقيقه

دانلود پایان نامه ارشد

بود. سپس به تمام لوله ها 5 ميلي ليتر آب مقطر اضافه و به خوبي به هم زده شدند. بعد قرائت نوري با استفاده از اسپكتروفوتومتري در طول موج 540 نانومتر انجام شد. براي رسم منحني استاندارد در محور X غلظت مالتوز (mol/ml/ ) و در محور Y قرائت نوري قرار گرفته و منحني مربوطه رسم گردید.

نمودار2-2- منحني استاندارد مالتوز

ب- تعيين فعاليت آنزيم آلفا- آميلاز
ابتدا 250 ميكروليتر از عصاره آنزيمي رقيق شده با آب مقطر سرد به لوله آزمايشي و 250 ميكروليتر آب مقطر نيز به لوله ديگري به عنوان شاهد با پيپت وارد شد. سپس عمل انكوباسيون به مدت 3-4 دقيقه در 25 درجه سانتيگراد انجام شد تا به دماي تعادل برسند. سپس 250 ميكروليتر از نشاسته 1 درصد به لوله ها اضافه گرديد و عمل انكوباسيون دقيقا به مدت 3 دقيقه انجام شد. بعد از 3 دقيقه 5/0 ميلي ليتر از معرف رنگي دي نيترو ساليسيليك اسيد به لوله ها اضافه گرديد و به مدت 5 دقيقه لوله ها از حمام خارج شده و در دماي اتاق خنك شدند سپس 5 ميلي ليتر آب مقطر به لوله ها اضافه گرديد و بعد محتويات لوله ها به خوبي مخلوط شده و قرائت نوري در 540 نانومتر انجام گرفت. سپس قرائت نوري انجام شده در منحني استاندارد مالتوز قرار گرفته و ميزان مالتوز رهاسازي شده تحت اثر آنزيم بر روي سوبسترا (نشاسته) بدست آمد. واحد فعاليت آلفا- آميلاز،بر حسب ميكرو مول مالتوز آزاد شده تحت اثر آنزيم در دقيقه به ازاي ميلي گرم پروتئين از طريق فرمول زير محاسبه شد (Worthington، 1991).
فاکتور رقت *
ميزان مالتوز آزاد شدmol) µ(
= ميزان پروتئين (mg) / فعاليت آنزيمي (U)

مدت زمان انکوباسيون (دقيقه) * ميزان پروتئين در نمونه (mg)

4-7-2- سنجش فعاليت آنزيم ليپاز
فعاليت ليپازي با استفاده از هيدروليز p-nitrophenylemyristate و به طريق اسپكتروفتومتري تعيين گرديد.

معرف :
1- محلول سوبسترا
شامل 53/0 ميلي مولار از p-nitrophenylemyristate، 25/0 ميلي مولار از 2- methoxy ethanol، 5 ميلي مولار از sodium cholate و 25/0 مولار Tris- HCl در pH 9 مي باشد.
2- محلول n-heptane / acetone
3- براي تهيه اين محلول 5 قسمت از استون با 2 قسمت از ان- هپتان با هم مخلوط شدند. اين محلول بعلت نقطه تبخير پايين بايد در ظروف درب دار نگهداري شود.
4- روش کار
5- براي هر سنجش ليپازي 5 ميكروليتر از عصاره آنزيمي به 5/0 ميلي ليتر محلول سوبسترا اضافه و به مدت 15 دقيقه در دماي 30 درجه سانتيگراد انكوباسيون شدند سپس واكنش با افزودن 7/0 ميلي ليتر از محلول (v/v ، 5:2) n- heptane/ acetone متوقف گرديد. مخلوط واكنش بعد از هم زدن كامل به مدت 2 دقيقه درg 6080 و در دماي 4 درجه سانتيگراد سانتريفوژ شد و ميزان جذب لايه ماوي (aquatic) زيرين در 405 نانومتر قرائت گرديد (Iijiama، 1998).
6- شاهد نيز مانند نمونه بالا آماده سازي شد با اين تفاوت كه محلول آنزيمي پس از افزودن محلول (v/v ، 5:2) n- heptane / acetone به لوله آزمايش اضافه شد.

حجم محلول درون کوت (ml) * 1000* (مدت زمان انکوباسيون / ( nm405) ميزان جذب)

= ميزان پروتئين (mg) / فعاليت آنزيمي (U)
ميزان پروتئين در نمونه (mg) * 16500

16500 ضريب ثابت مولكولي يا ضريب تاريكي براي پارا- نيتروفنل است.

5-7-2- سنجش فعالیت آنزیم پروتئاز :
سنجش فعالیت آنزیم پروتئاز با استفتده از محلول سوبسترا آزوکازئین 5/1% در 50 میلی مولار بافر Tris/Hcl در5/7 = pH پذیرفت. 20 میلی لیتر از نمونه عصاره آنزیمی با 5/0 میلی لیتر بافر Tris/Hcl در دمای 25 درجه سانتیگرا مخلوط شد. سپس 5/0 میلی لیتر از محلول TCA (Trichloroacetic acide) می شود که این آغاز واکنش است. پس از 10 دقیقه انکوباسیون در دمای 25 درجه سانتیگراد میکروتیوبها در دستگاه سانتریفیوژ میکروتیوب (اسم دستگاه) به مدت 5 دقیقه با سرعت g × 6500 سانتریفیوژ شدند. و سپس محلول رویی میکروتیوبها را داخل میکرپلت ته صاف ریخته و میزان جذب با دستگاه اسپکتوفتومتری مدل(اسم دستگاه) با طول موج 440 نانومتر قرائت شدند. برای گروه شاهد نیز از آب مقطر استفاده می شد. و در نهایت میزان فعالیت آنزیمی با تعیین میزان جذی نوری در طول موج 440 نانومتر به ازای مدت انکوباسیون (10دقیقه) و میزان پروتئین عصاره آنزیمی (میلیگرم) محاسبه می شود(Garcia-carreno et al,1993) .

8-2- بررسیهای ایمني شناسي
در پایان دوره 9 ماهي از هر تیمار به طور تصادفي انتخاب شده و پس از بيهوشي در محلول پودر گل ميخك اقدام به خونگيري شده نمونه خون وریدی اخذ شد و سپس سرم نمونه خون جدا شده و تست لیزوزیم و فعالیت راه ميانبر سیستم کمپلمان مورد ارزیابی قرار گرفت.

1-8-2- خون گیری و تهيه سرم
پس از بیهوشی ماهیان، خونگیری در شرایط استریل از ورید ساقه دمی با استفاده از سرنگ یکبار مصرف با سر سوزن سایز 22 صورت گرفت. پس از خون گیری، خون به یک لوله استریل منتقل و اجازه داده شد به مدت یک ساعت در دمای اتاق منعقد گردد. سپس 5 ساعت دیگر در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری شد. در پایان این مدت برای تهیه سرم نمونهها با دور g× 1500 به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شدند.
2-8-2- فعالیت راه ميانبر سيستم کمپلمان:
فعالیت راه ميانبر کمپلمان بر اساس همولیز گلبولهای قرمز خرگوش (RaRBC) و به کمک Boesen وهمکاران (1999) و Amarوهمکاران (2000) اندازه گیری شد. به طور خلاصه، گلبولهای قرمز خرگوش سه مرتبه با بافر اتیلن گلیکول تترا استیک اسید- منیزیوم- ژلاتین ورونال (10/0 مولار، 7=pH، شسته شده و تعداد سلولهای آن به کمک لام نئوبار در هر میلی لیتر بافر cell/ml 108 × 2 تنظیم شد. ابتدا دانسیته نوری14 لیز درصد گلبولهای قرمز خرگوش با افزودن 100 میکرولیتر از سوسپانسیون فوق به 4/3 میلی لیتر آب مقطر تعیین گرديد. برای اینکار مخلوط فوق با دور g×1600 به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شده و دانسيته نوري محلول رویی در طول موج 414 نانومتر به کمک دستگاه اسپکتروفتومتر محاسبه شد. سپس نمونههای سرم ابتدا 100 مرتبه با بافر فوق رقیق شدند. حجمهای متفاوتی از آن در هفت لوله آزمایش استریل تهيه شده و حجم همه لولهها به کمک بافر به 250 میکرولیتر رسانده شد. سرانجام به همه لولهها 100 میکرولیتر گلبول قرمز خرگوش اضافه گرديد. مخلوط فوق به مدّت 90 دقيقه در دمای 20 درجه سانتیگراد انکوبه شد. در این مدت به طور متناوب هر 15 دقیقه یکبار لولهها تکان داده شدند. در پایان به هر کدام از لولهها ml 15/3 محلول 87/0 درصد کلرید سدیم اضافه شد. سپس لولهها با دور g×1600 به مدت 10 دقیقه و دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شده و دانسيته نوري محلول رویی با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 414 نانومتر محاسبه شد. برا ی محاسبه میزان فعالیت راه ميانبر سيستم کمپلمان با استفاده از کاغذ شطرنجی15 منحنی لیز رسم شد. طبق تعریف حجمی از سرم که سبب 50 درصد همولیز شود عبارتست از فعالیت کمپلمان نمونه و از رابطه زیر محاسبه شد:
5/0 × (فاکتور رقت) × K = (U/ml) ACH505
در رابطه فوق K مقداری از سرم بر حسب ml است که موجب 50 درصد همولیز میشود. 5/0 عدد ثابت بوده و فاکتور رقت در این تست 01/0 میباشد چون سرم 1:100رقیق شده است.

نحوه تهیه بافرها
* بافر PBS
جدول 5-2- ترکیب بافر PBS
مولاریته (میلی مول)
مقدار(g/l)
نام ماده
7/2
2/0
KCL
5/1
2/0
KH2PO4
9/136
8
Nacl
1/8
2/2
Na2HPO42H2O
20
21/5
HEPES بدون نمک

* بافر اتیلن گلیکول تترا استیک اسید-منیزیوم-ژلاتین ورونال
محلول A: 804/3 گرم اتیلن گلیکول تترا استیک اسید (EGTA) به همراه 72/0 گرم هیدروکسید سدیم (NaOH) به 250 میلی لیتر آب دیونیزه16 افزوده شده و پس از تنظیم pH روی 5/7 حجم محلول به 500 میلی لیتر رسانده میشود.
محلول B: حل كردن 2033/0 گرم MgCl2.6H2O در 100 میلی لیتر آب دیونیزه (مولاریته، 10 میلی مول).
محلول C: در یک ظرف جداگانه مقدار 1/0 گرم ژلاتین را در 100 میلی لیتر آب دیونیزه داغ حل شود. سپس 88/4 گرم کلرید سدیم به همراه 9/0 گرم باربیتورات سدیم17 و 64/0 اسید کلریدریک در ظرف دیگری ریخته و حجم نهایی به یک لیتر رسانده شود. جهت آماده کردن محلول C، 10 میلی لیتر از محلول ژلاتین با 200 میلی لیتر محلول قبلی مخلوط شده و حجم نهایی به یک لیتر رسانده میشود. این محلول به مدت 48 ساعت در دمای 4-2 درجه سانتی گراد قابل نگهداري است.
محلول D: مقدار 25 گرم D- گلوکز در 500 میلی لیتر آب دیونیزه حل گردد.

محلول کاری بافر:
محلول A
محلول B
محلول C
محلول ِD
50 میلی لیتر
35 میلی لیتر
104 میلی لیتر
311 میلی لیتر
سپس pH محلول روی 6/7-4/7 تنظیم گردد. ( Waley and North, 1997).

3-8-2- فعالیت لیزوزیم:
فعالیت لیزوزیم سرم بر اساس روشClerton و همکاران (2001) ، Kim وAustin (2006) و بر مبنای لیز باکتری گرم مثبت حساس به آنزیم لیزوزیم یعنی میکروکوکوس لیزودیکتکوس18 (Sigma, M 3770, St. Louis, USA) اندازه گیری شد. به طور خلاصه، سرم مورد آزمایش چهار مرتبه با استفاده از بافر سیترات – فسفات (1/0 مولار، pH=5/8) و ضریب رقّت یک دوم رقیق شده و 100 میکرولیتر از رقّتهای سرم در چاهکهای میکروپلیت 96 خانهای (ته صاف) ریخته شد. سپس به هر کدام از چاهکها 100 میکرولیتر از سوسپانسیون تهیه شده باکتری در همان بافر (µg/ml75) افزوده شده و بلافاصله نمونهها مخلوط شدند. سپس اجازه داده شد این واکنش در دمای 25 درجه سانتیگراد صورت گیرد. در نهايت جذب نوری19 نمونهها هر 30 ثانیه یکبار تا 5/4 دقیقه به کمک الایزا ریدر در طول موج 530 نانومتر قرائت شد و از بافر سیترات – فسفات به عنوان بلانک استفاده شد. همچنین برای کنترل منفی از بافر فوق به جای سرم استفاده گردید. در نهایت طبق تعریف یک واحد فعالیت لیزوزیم عبارت خواهد بود از مقدار سرمی که سبب کاهش جذب نوری به مقدار 001/0 در دقیقه شود.
طرز تهیه بافر سیترات فسفات
ابتدا محلول ذخیره (استوک) فسفات (1/0 مولار) با افزودن 903/8 گرم NaHPO4.2H2O به 500 میلی لیتر آب مقطر تهیه شده، سپس محلول ذخیره سیترات (1/0 مولار) با افزودن 1014/2 گرم اسید سیتریک در 100 میلی لیتر آب مقطر تهیه میشود. در نهایت برای تهیه 100 میلی لیتر محلول کاری، 70 میلی لیتر از محلول ذخیره فسفات در یک ظرف استریل ریخته آنقدر محلول ذخیره اسید سیتریک به آن اضافه میشود تا pH محلول روی 8/5 تنظیم گردد. سپس به آن 90 میلی گرم NaCl به آن افزوده شده و محلول کاری با استفاده از فیلتر میلی پور استریل ميشود. (تکمه چی. ا، 1386).

4-8-2- اندازه گيري ميزان توتال ايمونوگلوبولين(Total immunoglobolin)
براي اندازه گيري اين فاکتور ايمني از روش Bradford protein assay استفاده مي شود، و اساس کار در اين روش بر مبناي ميزان جذب نوري است که محلول Coomassie Brilliant Blue G-250 (به عنوان ماده رنگ پذير) هنگام اتصال با پروتئين هاي نمونه در طول موج nm 595 نشان مي دهد.
خلاصه روش کار به اين ترتيب است که مقدار μlitr100 از سرم نمونه را با ml 5 معرف حاوي Coomassie Brilliant Blue G-250 درون تويوپ مخصوص مخلوط کرده و در طول موج nm 595 ميزان جذب نوري آن قرائت شده و با استفاده از منحني استاندارد ميزان توتال ايمونوگلوبولين محاسبه مي شود.
9-2- بررسي فاكتورهاي خوني
در پایان دوره 9 ماهي از هر تیمار به طور تصادفي انتخاب شده و پس از بيهوشي در محلول پودر گل ميخك اقدام به خونگيري شده و پس از افزودن ماده ضد انعقاد هپارین به آن جهت بررسي فاكتورهاي خوني نظير تعداد گلبول هاي سفيد و قرمز در ميكروليتر خون، هماتوكريت و هموگلوبین مورد استفاده قرار مي گيرد.

1-9-2- شمارش تعداد گلبول هاي سفيد در ميكروليتر خون
براي شمارش گلبول هاي سفيد ابتدا خون حاوي ماده ضد انعقاد را به نسبت 1 به 200 با محلول نات-هريك (Nott Herick) (20 ميكروليتر خون حاوي هپارین در 4 ميلي ليتر محلول نات-هريك) رقيق كرده، سپس حجم آن را با آب مقطر به 1000 ميلي ليتر

پایان نامه
Previous Entries دانلود پایان نامه درمورد نمونه برداری Next Entries دانلود پایان نامه درمورد کره جنوبی