دانلود پایان نامه ارشد درمورد آزمايش، ميکروليتر، پليت، نوري

نمونه

جذب نوري استاندارد

3-13-3-7 اندازه‌گيري AST
اين آزمايش به دستگاه اسپکتروفتومتر با طول موج‌هاي 365، 340 و334 نانومتر نياز دارد. تمام مواد لازم براي آزمايش به‌صورت کيت تجاري AST موجود است. براي انجام آزمايش صد ميکروليتر نمونه سرم با هزار ميکروليتر محلول کار (موجود در کيت) مخلوط شد و به‌مدت يک دقيقه در دماي 37 درجه سانتي‌گراد انکوبه شد. جذب نوري نمونه در فواصل يک، دو و سه دقيقه در طول موج‌هاي مورد اشاره قرائت شد. نتيجه به‌صورت فرمول صفحه بعد محاسبه شد.
جذب نوري نمونه در دقيقه × 1780 334 نانومتر
جذب نوري نمونه در دقيقه × 1746 340 نانومتر
جذب نوري نمونه در دقيقه × 3235 365 نانومتر
مقدار اختلافات جذب نوري به‌دست آمده پس از دقايق يک، دو و سه با هم جمع شد و بر عدد سه تقسيم شد و در ضرايب مربوط در بالا ضرب شد.
3-13-3-8 اندازه‌گيري ALT
اين آزمايش به دستگاه اسپکتروفتومتر با طول موج‌هاي 365، 340 و334 نانومتر نياز دارد. تمام مواد لازم براي آزمايش به‌صورت کيت تجاري ALT موجود است. براي انجام آزمايش صد ميکروليتر نمونه سرم با هزار ميکروليتر محلول کار (موجود در کيت) مخلوط شد و به‌مدت يک دقيقه در دماي 37 درجه سانتي‌گراد انکوبه شد. جذب نوري نمونه در فواصل يک، دو و سه دقيقه در طول موج‌هاي مورد اشاره قرائت شد. نتيجه به‌صورت زير محاسبه شد.
جذب نوري نمونه در دقيقه × 3235 334 نانومتر
جذب نوري نمونه در دقيقه × 1746 340 نانومتر
جذب نوري نمونه در دقيقه × 1780 365 نانومتر
مقدار اختلافات جذب نوري به‌دست آمده پس از دقايق يک، دو و سه با هم جمع شد و بر عدد سه تقسيم شد و در ضرايب مربوط در بالا ضرب شد.
3-13-3-9 اندازه‌گيري پروتئين کل
اين آزمايش به دستگاه اسپکتروفتومتر با طول موج‌ 546 نانومتر نياز دارد. تمام مواد لازم براي آزمايش به‌صورت کيت تجاري پروتئين کل موجود است. براي انجام آزمايش بيست ميکروليتر نمونه سرم با هزار ميکروليتر محلول مخلوط شده يک و دو (موجود در کيت) مخلوط شد و به‌مدت پنج دقيقه در دماي 37 درجه سانتي‌گراد قرار گرفت و حداکثر طي شصت دقيقه، جذب نوري استاندارد و نمونه قرائت شد. نتيجه به‌صورت زير محاسبه شد.

غلظت پروتئين توتال (گرم/دسي‌ليتر) در نمونه= غلظت استاندارد×
جذب نوري نمونه

جذب نوري استاندارد

3-13-3-10 اندازه‌گيري آلبومين
اين آزمايش به دستگاه اسپکتروفتومتر با طول موج‌ 546 نانومتر نياز دارد. تمام مواد لازم براي آزمايش به‌صورت کيت تجاري آلبومين موجود است. براي انجام آزمايش ده ميکروليتر نمونه سرم با هزار ميکروليتر معرف (موجود در کيت) مخلوط شد و به‌مدت ده دقيقه در دماي 37 درجه سانتي‌گراد قرار گرفت و حداکثر طي شصت دقيقه، جذب نوري استاندارد و نمونه قرائت شد. نتيجه به‌صورت زير محاسبه شد.

غلظت آلبومين (گرم/دسي‌ليتر) در نمونه= غلظت استاندارد×
جذب نوري نمونه

جذب نوري استاندارد

3-13-3-11 اندازه‌گيري گلوبولين
مقدار گلوبولين از تفاضل پروتئين کل از آلبومين به‌دست آمد و به‌صورت گرم دردسي‌ليتر گزارش شد.
3-13-4 اندازه‌گيري سيستم ايمني
در روزهاي مختلف دوره پرورش جوجه‌هاي گوشتي و بر اساس برنامه‌اي تدوين شده، خونگيري از جوجه‌ها به‌منظور سنجش عيار پادتن توليد شده عليه تزريق واکسن‌هاي ويروس نيوکاسل، آنفلوآنزا، برونشيت و تزريقSRBC (هر کدام در دو نوبت) انجام شد. براي تعيين عيار پادتن توليد شده عليه تزريق واکسن‌هاي ويروس نيوکاسل و آنفلوآنزا در آزمايشگاه از آزمايش HI، تعيين عيار پادتن توليد شده عليه تزريق واکسن ويروس برونشيت از آزمايش الايزا و جهت تعيين عيار پادتن توليدشده عليه SRBC از آزمايش HA استفاده شد.
3-13-4-1 آزمايش HI
براي انجام آزمايش HI، ابتدا بايد آزمايش HA انجام گيرد. تفاوت‌هايي در روش انجام آزمايش HA و HI در بسياري از آزمايشگاه‌ها وجود دارد. روش مورد اشاره در ذيل با استفاده از پليت‌هاي پلاستيکي ميکروتيتر V ‌شکل انجام ميشود که در پايان کار مقدار حجم در هر دو آزمايش 075/0 ميلي‌ليتر خواهد بود. مواد مورد نياز براي اين آزمايش‌ها محلول بافر فسفات243 (1/0مولار) ايزوتونيک با 2/7-7=pH و گلبول‌هاي قرمز خون يک درصد جوجه است؛ که براي تهيه آن بايد حداقل از سه جوجه عاري از پاتوژن244 خونگيري به‌عمل آيد (اگر جوجه‌هاي SPF در دسترس نباشد بايد از جوجه‌هايي خونگيري کرد که فاقد تيتر آنتي بادي نيوکاسل و آنفلوآنزا باشند).
3-13-4-2 روش انجام آزمايش HA
* 025/0 ميلي‌ليتر PBS به هر خانه پليت ميکروتيتراضافه شد.
* 025/0 ميلي‌ليتر آنتي‌ژن در خانه اول پليت ميکروتيتر ريخته و رقت سريالي تهيه شد.
* 025/0 ميلي‌ليتر از PBS به همه خانه‌هاي پليت ميکروتيتر افزوده شد.
* 025/0 ميلي‌ليتر از محلول RBC يک درصد به همه خانه‌هاي پليت ميکروتيتر افزوده شد.
* به‌آرامي و با چند ضربه مواد پليت ميکروتيتر مخلوط شد و به‌مدت چهل دقيقه در دماي آزمايشگاه (بيست ‌درجه سانتي‌گراد) قرار داده شد.
بالاترين رقتي از آنتي‌ژن که آگلوتيناسيون کامل را ايجاد کند واجد يک واحد HA (1 HAU) است. از آنتي‌ژن مورد استفاده، آنتي‌ژن چهار واحده (4 HAU) تهيه شد.
3-13-4-3 روش انجام آزمايش HI
* 025/0 ميلي‌ليتر از PBS به تمام خانه‌هاي پليت ميکروتيتر افزوده شد.
* 025/0 ميلي‌ليتر سرم خون به خانه اول پليت ميکروتيتر افزوده شد.
* رقت‌هاي سريالي تهيه شد.
* 025/0 ميلي‌ليتر از آنتي ژن واجد چهار واحد HA به همه خانه‌هاي پليت ميکروتيتر افزوده شد و به‌مدت سي دقيقه در دماي آزمايشگاه (بيست درجه سانتي‌گراد) قرار داده شد.
* 025/0 ميلي‌ليتر از گلبول قرمز يک درصد جوجه به تمام خانه‌هاي پليت ميکروتيتر افزوده شد و به مدت چهل دقيقه در دماي آزمايشگاه (بيست درجه سانتي‌گراد) يا يک‌ساعت در دماي چهار درجه سانتي‌گراد قرار داده شد.
تيتر HI ، بالاترين رقتي از سرم است که مهار کامل آگلوتيناسيون را موجب شود (اوآي ائي245، 1996).
3-13-4-4 روش انجام آزمايش الايزا
روش الايزا به‌طور معمول براي اندازه‌گيري كمّي سطوح پروتئين استفاده مي‌شود و تفاوت‌هاي بسياري درباره اساس اين روش سنجش وجود دارد. در ساده‌ترين شكل، پروتئين مورد سنجش246 به‌وسيله پيوندش به آنتيژن اختصاصي كه در پليت 96 خانه وجود دارند (اگر آناليت آنتيبادي باشد) يا اين‌كه با استفاده از آنتيبادي اختصاصي براي آناليت گرفته ميشود. سپس آناليت گرفته‌شده با استفاده از آنتيبادي ثانويه كه يك آنزيم است و كونژوگه ناميده ميشود مورد شناسايي قرار ميگيرد. مرحله بعد افزودن سوبسترا به آنزيم است كه متناسب با وجود آنزيم باعث تغيير رنگ ميشود. چندين مرحله شستشو در بين مراحل انجام آزمايش الايزا وجود دارد كه واكنش‌هاي غير‌اختصاصي را حذف ميكند. بنابراين توسعه رنگ سوبسترا به‌طور مستقيم متناسب با مقدار آناليت موجود در نمونه است (رودني247، 2010).

روش الايزا بسيار اختصاصي، كمّي، تجديد‌‌پذير و آسان براي آناليز مقدار زيادي نمونه است و براي اندازه‌‌گيري دامنه وسيعي از پروتئين‌ها استفاده ميشود؛ بدين‌منظور كيت‌هاي الايزا به‌صورت تجاري در دسترس است. در تحقيق حاضر آزمايش الايزاي برونشيت با استفاده از کيت تجاري شرکت بايوچک و به‌صورت زير انجام شد.
* نمونه سرم خون به‌نسبت يک به پانصد با محلول بافر (موجود در کيت) رقيق شد (يک ميکروليتر سرم خون + 499 ميکروليتر محلول بافر).
* صد ميکروليتر سرم رقيق شده به خانه‌هاي پليت الايزا منتقل شد و به‌مدت سي دقيقه در دماي آزمايشگاه انکوبه شد ( 22-27 درجه سانتي‌گراد).
* بعد از پايان مدت انکوباسيون، مواد موجود در پليت دور ريخته شد و پليت سه بار، و هر بار با سيصد ميکروليتر محلول مخصوص شستشو (موجود در کيت)، شستشو داده شد.
* صد ميکروليتر از محلول کونژوگه آنتي‌بادي (موجود در کيت) به خانه‌هاي پليت الايزا افزوده شد و به‌مدت سي دقيقه در دماي آزمايشگاه انکوبه شد ( 22-27 درجه سانتي‌گراد).
* بعد از پايان مدت انکوباسيون، مواد موجود در پليت دور ريخته شد و پليت سه بار، و هر بار با سيصد ميکروليتر محلول مخصوص شستشو (موجود در کيت)، شستشو داده شد.
* صد ميکروليتر از محلول سوبستراي کروموژن (موجود در کيت) به خانه‌هاي پليت الايزا افزوده شد و به‌مدت پانزده دقيقه در دماي آزمايشگاه انکوبه شد ( 22-27 درجه سانتي‌گراد).
* صد ميکروليتر از محلول استوپر (موجود در کيت) به خانه‌هاي پليت الايزا افزوده شد و جذب نوري پليت الايزا در طول موج 405 نانومتر دستگاه الايزا ريدر قرائت شد. نتيجه آزمايش توسط نرم‌افزار ارائه شده توسط شرکت بايوچک به‌صورت تيتر محاسبه و دريافت شد.
3-13-4-5 روش انجام آزمايش SRBC
* 25 ميکروليتر سرم فيزيولوژي به همه خانه‌هاي پليت ميکروتيتر افزوده شد.
* 25 ميکروليتر از نمونه سرم به خانه اول هر رديف افزوده شد.
* رقت‌هاي سريالي تهيه شد.
* 25 ميکروليتر از سوسپانسيون گلبول قرمز 25/0 درصد گوسفند به همه خانه‌هاي پلت ميکروتيتر افزوده شد.
* پليت را به آرامي تکان داده و به مدت سه ساعت در دماي 37 درجه سانتي‌گراد قرار داده شد.
* بالاترين رقتي از سرم که آگلوتيناسيون کامل را ايجاد کرد، به‌صورت تيتر گزارش شد.
* براي اندازه‌گيري ايمونوگلوبولين G، 25 ميکروليتر از 2- مرکاپتواتانول 20/0 مولار به خانه اول هر‌رديف پلت ميکروتيتر افزوده شد.
* 25 ميکروليتر سرم فيزيولوژي به خانه‌هاي ديگر پليت ميکروتيتر افزوده شد.
* 25 ميکروليتر نمونه سرم به خانه‌هاي حاوي 2- مرکاپتواتانول افزوده شد.
* بعد از يک ساعت انکوباسيون در دماي 37 درجه سانتي‌گراد، مراحل 7-4 تکرار شد.
* تيتر IgG ، بعد از انکوباسيون به‌صورتي که در بالا اشاره شد تعيين شد.
تيتر IgM با کم کردن تيتر IgG از تيتر همآگلوتنين کل تعيين شد (رودني، 2010).
3-13-5 کيفيّت گوشت
در پايان دوره پرورش جوجه‌هاي گوشتي از هر تيمار يک جوجه کشتار گرديد و گوشت سينه آن در روزهاي صفر، چهارم، هفتم و چهاردهم از لحاظ توليد اسيد تيوباربيتوريک مورد آزمايش قرار گرفت. لازم به ذکر است که در فواصل زماني بين روزهاي صفر تا چهاردهم آزمايش، گوشت جوجه‌هاي گوشتي در دماي چهار درجه سانتي‌گراد نگهداري شد تا فرآيند اکسيداسيون آغاز، و مقدار تيوباربيتوريک اسيد توليد شده به منظور قضاوت در مورد کيفيّت گوشت مورد سنجش قرار گيرد.
3-13-5-1 روش اندازه‌گيري TBA
اندازه‌گيري TBA بر اساس روش تارلادجيس248 و همكاران (1960) ميباشد. بر اين اساس ده گرم از نمونه گوشت هموژنيزه شد و به ظرف كجلدال حاوي 5/97 ميلي‌ليتر آب مقطر و 5/2 ميلي ليتر HCl شش نرمال منتقل شد. مخلوط حاصل تا زمان جمع‌آوري دويست ميلي‌ليتر از ماده تقطير حرارت داده شد. پنج ميلي‌ليتر از ماده تقطير به پنج ميلي‌ليتر تيوباربيتوريك اسيد 02/0 مولار افزوده شد و به مدت 35 دقيقه در بن ماري جوشان قرار گرفت. سپس زير شير آب سرد شد و جذب نوري آن در طول موج 538 نانومتر دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شد. در پايان ازضريب ثابت 8/7 براي محاسبه TBA استفاده شد.

فصل چهارم
نتايج
4-1 اثر پودر رزماري و ويتامين E بر عملکرد جوجه‌هاي گوشتي
4-1-1 اثر پودر رزماري و ويتامين E بر عملکرد جوجه‌هاي گوشتي در هفته اول
نتايج حاصل از اثر پودر رزماري و ويتامين E بر عملکرد هفته اول پرورش جوجه‌هاي گوشتي به‌طور خلاصه در جدول 4-1 نشان داده شد.
4-1-1-1 اثر پودر رزماري و ويتامين E بر خوراک مصرفي هفته اول
نتايج آزمايش نشان داده که پودر رزماري اثر معني‌داري (05/?P) برميزان خوراک مصرفي جوجه‌هاي‌گوشتي در هفته اول