به كيفيت و خلوص DNA حساس هستند بنابراين بهتر است قبل از شروع آزمايشات مولکولي از خلوص DNA مطمئن شد.
2-12 اندازه‌گيري غلظت DNA توسط اسپكتروفتومتري
قبل از اندازه‌گيري غلظت DNA نمونه‌ها، دستگاه Biophotometer)) كاليبره شد. اين كار با بافر TE يا آب مقطر دو بار استريل در طول موج 280/260 نانومتر صورت گرفت. به منظـور انجام اين كار 45 ميكروليتر از بافـر TE يا آب مقـطر به كـوت26 اضـافه و سپس در طـول موج 280/260 كاليبره و صفر شد. پس از آن 5 ميكروليتر از نمونه DNA به آن اضافه و ميزان جذب نور1 يا OD آن اندازه‌گيري شد. در صورتي كه نسبت 280 OD/ 260 OD نانومتر در حدود 2-8/1 بود، نشان‌دهنده كيفيت بالايDNA است و DNA از كيفيت مطلوبي براي PCR برخوردار است. نسبت كمتر از 6/1 نمايانگر حضور پروتئين و ساير آلودگيها ميباشد. در اين حالت توصيه مي‌گردد كه دوباره DNA رسوب داده شود. نسبتهاي بالاتر از 8/1 نشان‌دهنده وجود اسيدهاي نوكلئيك است. نسبتهاي بالاتر از 2 نشان‌دهنده آلودگي نمونه به RNA است.وجود ناخالصيهايي مانند پروتئين در عمل برشDNA ايجاد مشكل ميكنند. اين دستگاه غلظت DNA را به طور مستقيم بر حسب نانوگرم محاسبه ميكند ولي دقت بالايي ندارد به اين منظور از دستگاه اسپكتروفتومتر (530 DU Beckman)استـفاده شد.
پس از اندازه‌گيري غلظتDNA در طول موج 260 و 280 نانومترو محاسبه نسبت 280/260، غلظت DNA از زير روش محاسبه مي گردد.
ضريب رقت ×50 ×260 OD = غلظت DNA (ميكروليتر/نانوگرم)
ضريب رقت: ميزان رقت محلول پايه DNA است كه در اينجا 10 : 1 ميباشد. عدد 50 ضريب تصحيح دستگاه است زيرا ثابت شده كه مقدار پرتو نور ماورائ بنفش جذب شده بهوسيله محلول DNA بطور مستقيم نسبتي از مقدار DNA موجود در نمونه ميباشد و معمولا در طول موج جذبي 260 نانومتر برابر با يك معادل 50 نانوگرم DNA دو رشته‌اي در ميكروليتر است.
2-13 اندازه‌گيري غلظت DNA توسط ژل آگارز
در اين روش نمونههاي DNA پس از مخلوط شدن با 2-1 ميكروليتر بافر به صورت جداگانه در چاهك بارگذاري و از نشانگر اندازه III Hind با وزن مولكولي مشخص بهعنوان كنترل براي تخمين غلظت DNA استفاده شد. الكتروفورز با ولتاژ 70 براي مدت 40 دقيقه انجام شد و پس از آن رنگآميزي ژل محلول اتيديم برومايد(mg/ml10) به مدت 15-5 دقيقه انجام و ژل پس از شستشو در زير نور ماورائ بنفش در دستگاهUV transluminator مشاهده و غلظت نمونههاي DNA با الگوي نواربندي نشانگر مقايسه و تعيين غلظت شد.
براي رقيق و يكسان نمودن غلظت همه نمونه‌ها از فرمول زير استفاده گرديد.
N1V1= N2V2 رابطه (2-4):
N1 = غلظت DNA در محلول پايه
V1 = حجم محلول پايه كه مي‌بايستي برداشته شود.
= N2 ميزان DNA مورد نظر در محلول قابل مصرف
= V2 حجم كل محلولي كه مي‌بايستي تهيه شود.
کيفيت سنجي DNA از طريق ژل آگارز 7/0 درصد
2-14 تکنيک ISSR
واکنش ISSR با استفاده از آغازگرهاي مکمل با توالي‌هاي ريزماهواره‌اي همراه با يک نوکلئوتيد لنگري در انتهاي ‘3 يا ‘5 و سه نوكلئوتيد لنگري در انتهاي’5 آغازگر انجام گرفت. قبل از شروع آزمايشات دماي اتصال هر آغازگر روي DNA با کيفيت مناسب بررسي شد تا بهترين دماي اتصال براي هر آغازگر تعيين گردد. پس از پايان اين مرحله از مطالعات در مجموع 15 آغازگر ISSR که الگوي نواري مناسب و خوبي توليد کردند براي انجام واکنش‌هاي PCR انتخاب شدند. بهمنظور انتخاب دماي اتصال127 مناسب براي هر آغازگر، دما به صورت گراديانت در محدوده دمايي 45 تا 65 درجه سانتي‌گراد و طي 40 سيکل متوالي PCR مورد ارزيابي قرار گرفت و بدين ترتيب بهترين دماي اتصال براي هر آغازگر تعيين شد و در واکنش‌هاي ISSR از دماي اتصال بهينه انتخاب شده براي هر آغازگر استفاده شد. جدول 2-5 مشخصات و توالي نوکلئوتيدي آغازگرهاي مورد استفاده در اين آزمايش را نشان ميدهد.
جدول2-5: توالي آغازگرهاي ISSR مورد استفاده در بررسي تنوع ژنتيکي توده هاي خودگرده افشان و آزاد گرده افشان رازيانه
توالي آغازگر
رديف
5′-CTCTCTCTCTCTCTCT G-3′
1
5′-CACACACACACACACA G-3′
2
5′-TCTCTCTCTCTCTCTCC-3′
3
5′-ACACACACACACACAC G-3′
4
5′-ACACACACACACACAC YG -3′
5
5′-CACACACACACACACA VT-3’*
6
5′-CACACACACACACACA RT-3′
7
5′-GAGAGAGAGAGAGAGAT-3′
8
5′-GAGAGAGAGAGAGAGAYG-3’*
9
5′-HVH TCCTCCTCCTCCTCCTCCTCC-3’*
10
5′-CCACTCTCTCTCTCTCTCT-3′
11
5′-BDB TCCTCCTCCTCCTCCTCCTCC-3’*
12
5′-AGAGAGAGAGAGAGAGT -3′
13
5′-TCCTCCTCCTCCTCCYR-3’*
14
5′-TAGAGAGAGAGAGAGAGAG-3′
15
* نوع نوکئوتيدهاي degenerated بدين شرح است:
Y= G/C, V= AAA/G/C, R= A/T, H= A/T/C, D= A/C/G, B= T/G/C
آنزيم Taq DNApolymerase ، مخلوط نوكلئوتيدي (dNTPs) و بافر PCR از شركت Roche آلمان تهيه شد. مقدار 2 ميكروليتر از DNA تهيه شده با غلظت 10 نانوگرم در ميكروليتر (20 نانوگرم DNA) به 13 ميكروليتر از مخلوط واكنش PCR اضافه گرديد و در نهايت حجم محلول واكنش PCR با استفاده از آب دوبار تقطير دوبار يونيزه به 15 ميكروليتر رسيد. واکنش PCR در دستگاه ترموسايکلر اپندورف ((Mastercycler gradient انجام شد.
جدول 2-6 : اجزاء واکنش PCR و مقدار هر يك از آنها براي تهيه محلول پايه
ماده
غلظت نهايي
براي يک واکنش (?l)
بافر PCR با MgCl2
10x
5/1
كلريدمنيزيم MgCl2))
50mM
6/0
dNTPs
mM 10
3/0
فرم‌آميد
37%
3/0
آنزيم Taq DNA پليمراز
U/?l 5
4/0
آغازگر
pmol 10
2
آب دو بار تقطير يونيزه شده
—
9/7
جمع
—
15
جدول 2-7: برنامه PCR براي تکثير DNA ژنومي با نشانگر ISSR
تعداد دور
مرحله واکنش
زمان (دقيقه)
درجه حرارت (°C)
1 دور
واسرشته‌سازي اوليه DNA
2
94
40 دور
واسرشته‌سازي DNA
1
94
اتصال آغازگر به DNAتك‌رشته‌اي
1
48 – 60
بسط آغازگر
2
72
1 دور
تكميل بسط
10
72
2-15 تجزيه و تحليل‌هاي آماري
بعد از انجام واكنش تكثير با كمك آغازگرهاي ISSR، حضور و عدم حضور هر نوار خاص با اعداد 1 و 0 براي تودههاي مورد مطالعه مشخص شد و براي تشكيل ماتريس دادههاي خام، اعداد ستوني به باندهاي DNA و اعداد سطري به تودههاي رازيانه اختصاص يافت.
نمودار خوشهاي و تجزيه به مولفههاي اصلي تعديل شده (PCoA) با استفاده از نرم افزار NTSYS pc.2.02 انجام شد. محتواي اطلاعات چندشکلي (PIC) با استفاده از فرمول PICi = 2fi (1 – fi)محاسبه گرديد و در پايان مطالعات ژنتيک جمعيت در نمونههاي ايراني و خارجي با استفاده از نرم افزار Arlequin ver3 انجام گرفت.
2-16 تجزيه و تحليل دادههاي آناتوميک، مورفولوژيک و فيتوشيميايي
تجزيه واريانس براي صفات آناتوميک، مورفولوژيک، درصد و ترکيبات اسانس و فعاليت آنتياکسيداني بصورت آزمايش فاکتوريل در قالب طرح بلوک کامل تصادفي و با استفاده از نرم افزارهاي آماري SPSS ver20،SAS Ver 9.2 [163] و 2.21b NTSYSpc ver انجام گرفت و تمامي ماتريس‌هاي ورودي داده به کمک نرم افزار محاسباتي Excel 2010 تهيه و سپس به نرم افزارهاي مربوطه معرفي شد. مقايسه ميانگينها به روش حداقل تفاوت معنيدار (LSD) انجام شد و اجزاي متشکله واريانس با استفاده از اميد رياضي ميانگين مربعات طرح آماري برآورد گرديد (جدول2-8). قابليت توارث و ضرايب تنوع ژنتيکي و فنوتيپي با استفاده از روابط زير محاسبه گرديدند:
جدول 2-8: اميد رياضي مربوط به منابع تغييرات طرح آزمايشي انجام شده در اين مطالعه
منابعتغييرات
E (MS)
MS
تکرار
MSR
ژنوتيپ
MSG
خطاي آزمايشي
MSE
کل
MST
رابطه 2-5 (واريانس ژنتيکي) رابطه 2-6 (واريانس فنوتيپي) رابطه 2-7 (وراثتپذيري عمومي) رابطه 2-8 (ضريب تنوع ژنتيکي) رابطه 2-9 (ضريب تنوع فنوتيپي)
به منظور گروهبندي تودهها از تجزيه خوشهاي به روش ward بر مبناي فاصله اقليدسي از دادههاي استاندارد شده با استفاده از نرم افزار SPSS ver20 انجام شد.
جهت محاسبه پسروي ناشي از خويشآميزي (ID) تودهها در صفات مختلف از رابطه زير استفاده شد. مقادير مثبت پسروي خويشآميزي بيانگر اين است که تودههاي آزاد گرده افشان داراي ميانگين صفت بالاتري از تودههاي خودگرده افشان ميباشند در حاليکه مقدار منفي پسروي ناشي از خويشآميزي عکس اين مطلب را نشان ميدهد.
رابطه 2-10 100ID (%) = [ (Mop – Ms) / Mop ] ×
ميانگين صفت در توده آزاد گرده افشان= Mop
ميانگين صفت در توده خودگرده افشان Ms =
3 فصل سوم
نتايج و بحث
4-1- مطالعات آناتوميکي ساقه، دمبرگ و بذر در 23 تودههاي آزاد گرده افشان و خودگرده افشان رازيانه ايراني و خارجي
اين بخش از مطالعه به بررسي تنوع بين توده هاي مختلف خودگرده افشان و آزاد گرده افشان رازيانه از طريق ارزيابي آناتومي پرداخت. در اين بخش مجموعه اي از صفات کمي مورد بررسي قرار گرفتند. تودهها از يکديگر به وسيله ويژگيهاي آناتوميکي متمايز شدند.
4- 2- تجزيه واريانس صفات آناتوميک ساقه و دمبرگ
نتايج تجزيه واريانس صفات مورد نظر در جداول (3-1، 3-2 و 3-3) نشان داده شده است. تودههاي مورد مطالعه از نظر اکثر صفات تفاوت معنيداري را در سطح 1 و 5 درصد نشان دادند که بيانگر تنوع بالاي صفات مورد مطالعه در اين تحقيق بوده است. اين تفاوت معنيدار براي صفات مورد مطالعه بيانگر وجود تنوع زيادي بين تودهها ميباشد که علاوه بر شناسايي بافتهاي اندامهاي رويشي (ساقه و دمبرگ) و زايشي (بذر) تودههاي مختلف آزاد گرده افشان و خودگرده افشان رازيانه، ميتواند در جهت شناسايي روابط فيلوژني و حل مسائل فيلوژنتيک مفيد باشد.
3-1 مقايسه ميانگين صفات مورد مطالعه در بخش آناتوميک ساقه
نتايج مقايسات ميانگين براي صفات مورد مطالعه در جداول(3-4، 3-5، 3-6 و3-7)نشان داده شده است.
3-2 تشريح ساقه در تودههاي آزاد گرده افشان
مطالعات حاصل از تشريح مقايسهاي ساقه تودههاي آزاد گرده افشان نشان داد که توده شيروان بيشترين ضخامت ساقه (02/3 ميلي متر)، عرض سلول اپيدرم پشتي (081/0 ميکرومتر) و متوسط طول ستون اسکلرانشيمي (231/0 ميکرومتر) را به خود اختصاص داده است. توده انگلستان بيشترين طول سلول اپيدرمي پشتي (46 ميکرومتر)، ضخامت کوتيکول پشتي (013/0 ميکرومتر)، تعداد کانال ترشحي (33/40)، تعداد لايههاي سلولهاي کلرانشيمي (33/25)، تعداد لايههاي اپيدرمي (15) و بيشترين تراکم روزنهاي (33/14) را نشان داد. توده اردبيل بيشترين عرض سلول اپيدرمي پشتي (081/0 ميکرومتر) و شاخص روزنهاي (039/0 درصد) و کمترين نسبت طول به عرض سلولهاي اپيدرمي پشتي (82/0 درصد) را داشت. بيشترين دستجات
