دانلود تحقیق با موضوع ميلي، پلي، تهيه

دانلود پایان نامه ارشد

يابد. پلي مريزاسيون مونومرها و تشکيل شبکه با افزودن پرسولفات آمونيوم يا ريبوفلاوين شروع مي شود و براي تسريع آن از موادي نظير TEMED (N، N، N^’، N^” تترامتيل اتيل دي آمين) استفاده مي شود.
افزايش غلظت پرسولفات آمونيوم، TEMED و دماي بالا سرعت واکنش را افزايش مي دهند. برعکس pH پايين، دماي کم و اکسيژن ممانعت کننده پلي مريزاسيون هستند. بهتر است تمام محلول ها به کمک پمپ خلاء عاري از گاز هوا گردند. اندازه منافذ ژل بستگي به غلظت مونومرها (%T) و غلظت رابطه (Cross linker) دارد. با افزايش %T در يک C ثابت، قطر منافذ ژل کاهش مي يابد.
%T عبارتست از: نسبت مونومرهاي شرکت کرده در پيوند مونومرها- رابط به کل مونومرهاي محلول که از فرمول زير محاسبه مي شود.
%C=((بيس)رابط(گرم)×%100)/(آميد آکريل (گرم)+(رابط)گرم)
67/2%= C به طور معمول در بيشتر ژلها مورد استفاده قرار مي گيرد. غلظت مونومرها کلاً براي تفکيک بهينه بستگي به %T بهينه دارد. %T برحسب وزن مولکولي نمونه مورد مطالعه در انواع مختلف تهيه مي شود. %T برحسب وزن مولکولي نمونه مورد مطالعه در انواع مختلف تهيه مي شود. زماني ژل تهيه شده داراي قدرت بهينه است که حرکت نسبي (Relative mobility) نمونه مورد مطالعه بين 6/0-55/0 باشد. مقادير Rm براي پروتئين هاي اختصاصي از فرمول زير محاسبه مي شود.
R_f=(نظر مورد پروتئين توسط زيرين ژل در شده طي مسافت)/(بروموفنل توسط زيرين ژل در شده طي مسافت )
ب- سيستم بافري ژل:
سيستم بافري ژل تعيين کننده ي ولتاژ و مؤثر براي تفکيک است. سيستم بافري شامل بافر مورد استفاده در ژل و بافر Runnig است. آنها مي توانند سيستمهاي پيوسته يا ناپيوسته باشند.
سيستم بافري پيوسته: در اين سيستم بافرهاي با يونهاي يکسان و همين طور pH و غلظت يکسان براي هر دو بخش ژل و بافر Runnig به کار مي رود. ژل يک پارچه بوده و %T يکسان در تمام سطح خود دارد و نمونه به طور مستقيم در بخشي از ژل که در آن تفکيک انجام مي شود، قرار داده مي شود. يعني ژل تفکيک کننده است. در اين روش بايد غلظت نمونه ها بالا و حجم آنها کم باشد زيرا بخشي از نمونه ها به ديواره ي محل استقرار پيوند پيدا مي کنند.
سيستم ناپيوسته: در اين روش بافري هاي مختلف از نظر يون در ژل و محلول الکتروليت مورد استفاده قرار مي گيرد. همچنين ژل دو بخشي است. يک بخش کوچکتر، بخش Stacking است که نمونه ها در آن استقرار پيدا مي کنند و در اثر ميدان الکتريکي حرکت کرده و به صورت يک باند يک تکه به بخش اصلي ژل يعني ژل تفکيک کننده (Resoluing) مي رسند و سپس در آنجا به باندهاي متعدد تفکيک مي شوند. سيستم ناپيوسته براي پروتئين هاي طبيعي مورد استفاده قرار مي گيرد که بيشتر به عنوان روشSDS-PAGE مورد استفاده توسط Laemmli (1970) معرفي مي شود.

3-12-1- استخراج پروتئين ها از نمونه ها:
براي استخراج پروتئين از نمونه ها، ريشه هاي خشک خالص سازي شده را در هاون چيني ريخته و هاون را روي يخ قرار داده به آرامي به خرد کردن ريشه ها مي پردازيم تا به صورت پودر درآيد.
يک گرم پودر ريشه را وزن کرده و نسبت يک به شش (w/v) با بافر فسفات سديم (7= pH) مخلوط مي کنيم. به منظور جلوگيري از فعاليت آنزيم فنل اکسيداز و اثرات سوء آن در سنجش پروتئين و در نتيجه پايداري پروتئين ها از (PVP) پلي وينيل پيروليدون با وزن مولکولي 40000 بهره گرفته شد. سپس مخلوط حاصل را چندين بار به آرامي با شيکر Shaker به هم مي زنيم. مخلوط را دو ساعت در يخچال يا محيط سرد قرار مي دهيم. در اين فاصله مخلوط را مي توان با شيکر Shaker به هم زد. سپس در سانتريفوژ يخچالدار eppendorf centrifuge مدل R5415 با قدرت حداکثر 13200 دور در دقيقه، به مدت 25 دقيقه با 9000 دور در دقيقه و در دماي 6 درجه سانتي گراد سانتريفوژ گرديدند. با پايان يافتن عمل سانتريفوژ، محلول شفاف رويي را جدا کرده و در ويال هاي کوچ استريل در دماي ?20- نگهداري شدند تا در الکتروفورز مورد استفاده قرار گيرند. براي تهيه عصاره پروتئين دانه هاي گرده، دانه هاي گرده را در ويال ريخته و به آن بافر فسفات و PVP اضافه مي کنيم به مدت 24 ساعت در يخچال نگهداري کرده سپس با شيکر خوب هم مي زنيم و سانتريفوژ مي کنيم. با پايان يافتن عمل سانتريفوژ، محلول شفاف رويي را جدا کرده و در ويال کوچک استريل در دماي ?20- نگهداري شدند تا در الکتروفورز مورد استفاده قرار گيرند.

3-12-2- روش تهيه بافر فسفات سديم (7= pH)
محلول A: محلول 1/0 مولار Na_2 Hpo_4 است که از حل شدن 78/1 گرم از اين ماده در 100 ميلي ليتر آب مقطر به دست مي آيد.
محلول B: محلول 1/0 مولار Na_2 Hpo_4 است که از حل شدن 56/1 گرم از اين ماده در 100 ميلي ليتر آب مقطر به دست مي آيد.
60 ميلي ليتر از محلول A با 60 ميلي ليتر از محلول B مخلوط شده و در نهايت 952/2 گرم کلريد سديم به آن اضافه گرديد. pH محلول روي 7 تنظيم شد.
3-12-3- الکتروفورز به روش SDS-PAGE در سيستم ناپيوسته:
روشي است که به روي ژل پلي آکريل آميد صورت مي گيرد و براي تفکيک زير واحدهاي پروتئيني، تعيين وزن مولکولي آنها و تعيين خلوص ترکيبات پروتئيني به کار مي رود. در اين روش پروتئين ها در حضور سديم دودسيل سولفات (SDS) و 2- مرکايتواتانول (2 ME) و تحت تأثير حرارت 100 درجه سانتي گراد به زير واحدهاي پلي پپتيدي خود شکسته مي شوند.
در واقع 2 ME سبب احياي پلي هاي دي سولفيد (S-S) بين زنجيره اي شده و SDS که يک دترجنت آنيوني است با نسبت جرمي ثابت (4/1 گرم SDS به هر گرم پروتئين) به پلي پپتيدها متصل مي شود. اتصال SDS به پروتئين تحت تأثير pH، قدرت يوني، ترکيب بافر، غلظت SDS، احياي پيوندهاي دي سولفيد، ساختار اوليه و بار طبيعي پروتئين و بخش هاي غير پروتئيني که به آن متصل شده، مي باشد. در اين حالت کمپلکس پلي پپتيد- SDS به شکل يک مولکول ميله اي Rod like به قطر تقريب 18 آنگستروم در مي آيد که طول اين کمپلکس نيز متناسب با وزن مولکولي پلي پپتيد خواهد بود. اتصال SDS به مولکول پلي پپتيد، ايجاد يک بار منفي شديد مي کند که بار ذاتي خود مولکول پلي پپتيد را تحت تأثير قرار مي دهد.
کمپلکس هاي پلي پپتيد- SDS به جز چند استثنا داراي نسبت ثابت بار به جرم هستند و لذا در ژل هاي آکريل آميد براساس وزن مولکولي پلي پپتيد حرکت خواهند کرد. به اين ترتيب علاوه بر تفکيک پلي پپتيدها از هم مي توان با استفاده از شاخص ها (Marker) وزن مولکولي پلي پپتيدها را محاسبه نمود. باندهاي پلي پپتيدي به دست آمده روي ژل در روش SDS- PAGE را مي توان براي مقاصد مختلفي از جمله آناليز اسيدهاي آمينه، تهيه نقشه پپتيدي (Peptid mnapping) تعيين انتهاي N و C، توليد آنتي بادي اختصاصي و انتقال به يک غشاء و انجام واکنش هاي آنزيمي روي آن (Western blotting) به منظور شناسايي آنها، مورد استفاده قرار داد.

3-12-4- روش تهيه محلول ها و بافرهاي لازم در الکتروفورز:
الف) محلول پايه آکريل آميد- بيس آکريل آميد
آکريل آميد 786 گرم (2/29 گرم در 100 ميلي ليتر)
N^’ N^’- بيس- متيلن- آکريل آميد 4/2 گرم (8/0 گرم در 100 ميلي ليتر)
مقادير بالا به دقت وزن کرده و در مقداري آب مقطر (حدود 70 ميلي ليتر) حل نموده. حجم نهايي محلول را به 300 ميلي ليتر رسانديم. محلول را با کاغذ صافي صاف نموده و دور از نور در دماي 4 درجه سانتي گراد به مدت يک ماه قابل نگهداري است.
با طولاني شدن زمان نگهداري، مونومرهاي آکريل آميد به آکريليک اسيد و آمونياک هيدروليز مي گرداند.
تذکر: آکريل آميد و بيس آکريل به فرم مونومر سمي و نوروتوکسين قوي هستند. هنگام کار با اين مواد از ماسک و دستکش استفاده مي شود. بهتر است اعمال وزن کردن و تهيه محلول در زير هود انجام گيرد.
ب) محلول SDS 10%:
مقدار 10 گرم SDS را وزن کرده در 90 ميلي ليتر آب مقطر حل نموده، حجم نهايي را به 100 ميلي ليتر رسانديم و در دماي آزمايشگاه نگهداري کرديم. اين محلول در سرما رسوب مي کند.
پ) محلول پايه بافر ژل زيرين (تفکيک کننده) (8/8= PH و M Tris-Hcl 5/1)
ت) محلول پايه بافر ژل رويي (توده کننده) (8/6= PH و M Tris-Hcl 5/0).
مقدار 6 گرم تريس بازي را در 60 ميلي ليتر آب مقطر حل نموده، با استفاده از اسيد کلريدريک 6 نرمال pH محلول را روي 8/6 تنظيم کرده حجم نهايي محلول را با آب مقطر به 100 ميلي ليتر رسانديم و در دماي 4 درجه سانتي گراد ذخيره نموديم.

ث) محلول 1% APS (آمونيوم پرسولفات):
مقدار 1% گرم آمونيوم پرسولفات را در 1 ميلي ليتر آب مقطر حل نموديم، اين محلول ناپايدار بوده و بايد به سرعت مصرف کنيم.
ج) محلول پايه بافر نمونه (Sample buffer):
با مخلوط نمودن مواد زير اين بافر به دست مي آيد:
آب مقطر ml 55/3
بافر تريس M Hcl 5/0 , 7= PH , ml 25/1
گليسرول ml5/2
SDS 10% ml2
بروموفنل 5% (w/v) ml2/0
حجم کل محلول: ml 5/9
محلول فوق را در دماي آزمايشگاه نگهداري نموديم. هنگام استفاده به آن ?l 50، B- مرکاپتواتانول براي هر ?l 950 بافر نمونه اضافه نموده و بعد استفاده کنيد.
چ) محلول پايه بافر الکتروليت (بافر Running) x 10، 3/8= PH
(PH=8/3, Tris 0/25, Glycin 1/92 M. SDS x 10)
تريس بازي 303 گرم
گليسين 144 گرم
SDS 10 گرم
مواد فوق را در 5/0 ليتر آب مقطر حل نموده حجم نهايي محلول را با آب مقطر به 1 ليتر رسانديم و در دماي ?4 نگهداري کرديم.
هنگام الکتروفورز 50 ميلي ليتر از محلول فوق را با 450 ميلي ليتر آب مقطر رقيق نموده و مورد استفاده قرار داديم.
ح) محلول تثبيت کننده:
– اسيد تري کلرواستيک (TCA) 4/11 گرم
– اسيد سولفوساليسيليک 4/3 گرم
– متانول 30ميلي ليتر
موارد فوق را در 50 ميلي ليتر آب مقطر حل شده حجم نهايي محلول به 100 ميلي ليتر رسانده شد.
خ) محلول رنگ کننده ژل (Staining):
– رنگ کوماسي بلو بريليانت R_250 3/0 گرم
– متانول 10 ميلي ليتر
– اسيداستيک 10 ميلي ليتر
مواد فوق مخلوط شده حجم محلول را با آب مقطر به 100 ميلي ليتر رسانده شد و در دماي محيط نگهداري گرديد.
د) محلول رنگبر (Destaining):
– متانول 10 ميلي ليتر
– اسيداستيک 10 ميلي ليتر
– آب مقطر 8 ميلي ليتر
مواد فوق را با هم مخلوط کرده و در دماي آزمايشگاه نگهداري کرديم.

3-12-5- مراحل تهيه ژل SDS-PAGE:
در اين پژوهش از دستگاه الکتروفورز VERTICAL ELECTROPHORESIS UNIT استفاده شد .
مراحل آماده سازي دستگاه براي تهيه ژل به شرح زير است:
با دقت شيشه هاي قالب ژل با آب و شوينده ها شسته شده و با الکل تميز گرديد.
فضاسازها به دقت بين شيشه قرار داده شده و دو شيشه با گيره به هم متصل گرديد.
سطح فضا سازها آغشته به وازلين بود تا از نشت ژل جلوگيري شود. (ما در اين پژوهش به جاي وازلين مقداري از ژل زيرين را برداشته و TEMED به آن اضافه مي کنيم و بلافاصله به کمک سمپلر چند قطره به کناره هاي قاب تزريق مي کنيم و با حرکت چرخشي سه طرف قاب و آغشته به ژل مي کنيم وجود TEMED زياد باعث تسريع در بستن ژل شده و از نشت ژل در قالب جلوگيري مي کند. براي جلوگيري از نشت ژل، از ژل زيرين تهيه شده با مقدار TEMED بيشتر استفاده گرديد.
الف- روش تهيه محلول ژل زيرين (12%)
براي تهيه ژل زيرين يا تفکيک کننده مواد زير با هم مخلوط مي شوند. (جدول 1-3)

پایان نامه
Previous Entries پایان نامه با واژگان کلیدی آزمون فرضیه، سرمایه در گردش، مدیریت سرمایه Next Entries دانلود تحقیق با موضوع ميلي، 0.1، 0.5