O)m^2 بيان شده است.
ر- شاخص بردباري (TI):
TI شاخصي براي مقايسه وزن خشک کل (بخش هوايي يا ريشه) گياهان تحت تنش با تيمار شاهد مي باشد که فاقد واحد است.
TI=(نظر مورد تيمار در خشک وزن)/(شاهد تيمار در خشک وزن)
3-6- اندازه گيري مقدار رنگيزه هاي گياه:
الف- سنجش ميزان کلروفيل و کاروتنوئيد:
براي سنجش ميزان کلروفيل و کاروتنوئيد از روش Lichtenthaler (1987) استفاده شد. 2/0 گرم از برگ هاي جوان هم سن انتخاب و پس از تکه تکه شدن با کمک استون 80% (Merck) در داخل هاون چيني به صورت هموژن درآمدند. سپس لهيده هموژن تهيه شده با واتمن شماره 2 صاف گرديد. رقيق سازي عصاره به ميزان لازم به وسيله استون 80% صورت گرفت. براي محاسبه ميزان کلروفيل ها و کاروتنوئيدها جذب محلول در طول موج هاي 8/646، 20/663 و 470 نانومتر با استفاده از شاهد استون 80% خوانده شد. مقادير کلروفيل a، b و (a+b) با استفاده از روابط زير به دست آمد:
Chla=(12.25A_663.2-2.79A_646.8)
Chlb=(21.21A_646.8-5.1A_663.2)
ChlT=Chla+chlb
Car=(((1000A_470-1.8Chla-85.02Chlb))/198)
در اين فرمول Chla، Chlb، ChlTو Car به ترتيب غلظت کلروفيل a، کلروفيل b، کلروفيل کل و کاروتنوئيدها (شامل کاروتن ها و گزانتوفيل ها) مي باشد. غلظت بر حسب mg.?ml?^(-1) عصاره گياهي تعيين گرديد. نتايج حاصل از اندازه گيري مقدار رنگيزه هاي فتوسنتزي بر حسب ميلي گرم بر گرم وزن تر (mgg^(-1) FW) محاسبه و ارائه گرديدند.
ب- سنجش فلاونوئيدها:
براي سنجش فلاونوئيدهاي برگي از روش Swain (1976) استفاده شد. قطعات برگي (1/0 گرم) در حجم مشخصي از متانول خالص (5 ميلي ليتر) در دماي آزمايشگاه همگن گرديدند. بعد از سانتريفوژ کلروفيل ها و کاروتنوئيدها با استفاده از اتر نفت سبک با جداسازي فاز از محلول با کمک دکانتور حذف گرديدند.
در فاز متانولي پس از 2 بار رقيق سازي، طيف جذبي در ناحيه 400-200 نانومتر تعيين و قله حداکثر جذب در 240 نانومتر مشخص شد. براي محاسبه مقدار فلاونوئيدها با در نظر گرفتن جذب نمونه ها در 240 نانومتر و ضريب تصحيح ويژه فلاونوئيدها (700) از رابطه زير استفاده گرديد:
X=(Abs×V)/(?×100)
در اين رابطه X عبارت است از مقدار (گرم) فلاونوئيد در V ميلي ليتر محلول، Abs ميزان جذب نمونه در 240 نانومتر و ? ضريب تصحيح ويژه فلاونوئيدها معادل 700 در يک محلول 1% و مسير نوري cm1 براي کووت اسپکتروفتومتر مي باشد. غلظت نهايي فلاونوئيدها نيز براساس واحد ميلي گرم بر گرم وزن تر (mgg^(-1) FW) بيان گرديد.
ج- سنجش ميزان آنتوسيانين ها:
جهت اندازه گيري آنتوسيانين هاي برگ از روش Wagner (1979) استفاده شد. 1/0 گرم از بافت برگي را در هاون چيني با 10 ميلي ليتر متانول اسيدي (متانول خالص و اسيد کلريدريک خالص به نسبت حجمي 99: 1) کاملا سائيده و عصاره در لوله هاي آزمايش سرپيچ دار ريخته شد و به مدت 24 ساعت در تاريکي و دماي 25 درجه سانتي گراد قرار گرفت. سپس به مدت 10 دقيقه با سرعت 4000 دور در دقيقه سانتريفوژ و جذب محلول بالايي در طول موج 550 نانومتر اندازه گيري شد. براي محاسبه غلظت ضريب خاموشي (?) 33000 سانتيمتر بر مول در نظر گرفته شد.
A=?bc
=A جذب b= عرض کووت c= غلظت محلول مورد نظر
3-7- سنجش کربوهيدراتها((Kochert, 1978
مطابق با روش 3-3، رقم هاي لوبيا كشت داده شدند و براي اندازه‌گيري قندهاي محلول و نامحلول به روش فنل- اسيدسولفوريك، مورد استفاده قرار گرفتند.
3-7-1- اندازه‌گيري قندهاي محلول:
روش فنل- اسيدسولفوريك براساس هيدروليز اسيدي قندهاي محلول و ايجاد تركيب فورفورال قرار دارد كه با فنل توليد يك تركيب كمپلكس رنگي ايجاد مي‌كند. براي انجام آزمايش 1/0 گرم از ماده خشك اندام گياهي (ريشه و برگ) را با ترازوي دقيق به دقت 01/0 گرم وزن كرده، در لوله آزمايش ريخته بر روي آن 10 ميليليتر اتانل 70% اضافه كرده و به مدت يك هفته در يخچال قرار مي‌دهيم تا قندهاي محلول آن حل شوند. پس از يك هفته محلول رويي نمونه‌ها، براي ساقه و برگ 5/0 ميليليتر و براي ريشه 1 ميليليتر برداشته و حجم آنها را با آب مقطر به 2 ميليليتر مي‌رسانديم. بر روي آن 1 ميليليتر فنل 5 درصد اضافه كرده، خوب به هم مي‌زنيم و بر روي آن 5 ميليليتر اسيدسولفوريك غليظ با فشار اضافه نموديم، محلول زرد رنگي بدست مي‌آيد كه به مرور تغيير رنگ مي‌دهد و به قهوه‌اي روشن تمايل پيدا مي‌كند، اين محلول را نيم ساعت در دماي آزمايشگاه قرار مي‌دهيم تا هم خنك شده و هم رنگ نهايي به دست آيد (زيرا واكنش به شدت گرمازاست) سپس شدت رنگ حاصله را با استفاده از دستگاه اسپكتروفتومتر در طول موج 485 نانومتر خوانديم، ميزان جذب حاصله متناسب با شدت رنگ محلول و آن هم متناسب با غلظت قندهاي محلول خواهد بود.
مقادير قند نمونه‌ها با استفاده از منحني استاندارد براساس ميلي‌گرم بر وزن خشك ارزيابي گرديد. براي تعيين غلظت قندهاي محلول، ابتدا لازم است منحني استانداردي با استفاده از غلظت‌هاي معلوم گلوكز تهيه گردد و معادله منحني تغييرات غلظت‌هاي قندهاي محلول بدست آيد تا با استفاده از آن بتوان غلظت‌هاي نامعلوم محلول‌هاي مورد مطالعه را تعيين و نتايج را مورد بررسي قرار داد.
براي اين منظور غلظت‌هايي از گلوكز ( 0، 10، 20، 30 و 40 ميلي‌گرم بر ليتر) تهيه كرده و به روي هريك از آنها يك ميليليتر فنل 5 درصد و 5 ميليليتر اسيدسولفوريك غليظ اضافه كرده، پس از نيم ساعت جذب آنها را با اسپكتروفتومتر خوانده و معادله خطي آن را محاسبه كرده و سپس منحني استاندارد آنها را رسم نموديم. در پايان جذبهاي خوانده شده محلول نمونه‌هاي گياهي را در معادله خط حاصل قرار داده، مقدار قندهاي محلول نمونه‌هاي مجهول را برحسب ميلي‌گرم در ليتر تعيين نموديم (جدول 3-2).
جدول 3-2- جذبهاي خوانده شده براي تهيه منحني استاندارد قندهاي محلول
40
30
20
10
0
غلظت گلوكز (C)
192/1
944/0
649/0
381/0
0
جذب‌هاي‌خوانده شده(O.D)
فرمول كلي براي اين منظور عبارت است از:
Y = ax+b
X = غلظت و Y = مقدار جذب خوانده شده
پس از قرار دادن اعداد جدول در فرمول كلي منحني استاندارد، معادله كلي زير براي محاسبه قندهاي محلول بدست مي‌آيد.
(62/36) / (985/3+OD) = C
با استفاده از اين معادله و خواندن جذب نمونه‌هاي مجهول، مي‌توان غلظت قندها را در آنها بدست آورد.
نمودار 3-1- منحني استاندارد قندهاي محلول
3-7-2- اندازه‌گيري قندهاي نامحلول (نشاسته):
محلول اتانول محتوي نمونه‌هاي گياهي را كه براي قندهاي محلول استفاده كرديم، صاف نموده و از رسوب باقيمانده بر روي كاغذ صافي براي اندازه‌گيري نشاسته موجود در اندام‌هاي گياهي استفاده مي‌كنيم. ابتدا رسوب را خشك و سپس آن را وزن نموده و در لوله‌ي آزمايش ريخته و بر روي آن
10 ميليليتر آب مقطر اضافه نموده و به مدت 15 دقيقه در بن‌ماري آب جوش قرار داديم. سپس آن را صاف نموده و حجم محلول عبور كرده و از صافي را با آب مقطر به 25 ميليليتر مي‌رسانديم. در نهايت ml2 از اين محلول برداشته، قندهاي نامحلول و آن را به روش فنل- اسيدسولفوريك در طول موج 485 نانومتر در دستگاه اسپكتروفتومتر خوانده و با استفاده از منحني استاندارد و معادله به دست آمده، قندهاي محلول و قندهاي نامحلول را تعيين نموديم.
3-8- سنجش پرولين (Bates, et al., 1973)
ارقام لوبيا بر طبق روش 3-3 كشت داده شدند و براي سنجش پرولين مورد استفاده قرار گرفتند.
الف) تهيه معرف A (اسيد نينهيدرين):
25/1 گرم نينهيدرين را به 30 ميليليتر اسيداستيك خالص افزوده و مخلوط حاصل را در دماي پايين گرم نموديم تا نينهيدرين به خوبي در اسيد حل شود، سپس 20 ميليليتر اسيدفسفريك 6 مولار، به محلول اضافه گرديد. اين معرف در دماي 4 درجه سانتيگراد فقط به مدت 24 ساعت قابل استفاده مي‌باشد.
معرف B- اسيداستيك خالص
معرف C- تولوئن
ب) انجام آزمايش:
5/0 گرم بافت تر گياهي را وزن نموده در 10 ميليليتر محلول 3% اسيد سولفوساليسيليك سائيده، مخلوط همگن حاصل را با استفاده از كاغذ واتمن شماره 2 صاف نموده و از هركدام از محلول‌هاي حاصل 2 ميليليتر برداشته و در لوله آزمايش ريختيم. سپس به هريك از لوله‌هاي محتوي عصاره گياهي، 2 ميليليتر معرف اسيد نينهيدرين و 2 ميليليتر اسيداستيك خالص افزوديم. در مرحله‌ي بعد كليه لوله‌ها را در بن‌ماري با دماي 100 درجه سانتيگراد قرار داده و پس از يك ساعت لوله‌ها را بيرون آورده، جهت قطع آزمايش در حمام يخ قرار داده و به هركدام 4 ميليليتر تولوئن افزوديم و لوله‌ها را با استفاده از شيكر، به شدت تكان داديم و سپس با ثابت نگاه داشتن لوله‌ها به مدت 20 ثانيه دو لايه كاملاً مجزا تشكيل گرديد. از لايه رنگي فوقاني كه حاوي تولوئن و پرولين بود، جهت اندازه‌گيري غلظت پرولين استفاده كرديم، مقدار معيني از اين بخش جدا شده را در دستگاه اسپكتروفتومتر قرار داده در طول موج 520 نانومتر مقدار جذب را قرائت نموده و مقدار پرولين موجود را با استفاده از منحني استاندارد محاسبه نموديم اين منحني براساس خواندن جذب محلول‌هايي از پرولين با غلظت معلوم تهيه و براساس آن معادله محاسبه غلظت پرولين مجهول به دست مي‌آيد.
(78/20) / (672/0 + O.D) = C
C = غلظت پرولين
O.D = مقدار جذب خوانده شده
جدول 3-3- جذبهاي خوانده شده براي تهيه منحني استاندارد پرولين
30
20
10
5
1
1/0
0
غلظت پروتئين (C)
822/0
592/0
334/0
036/0
035/0
0
جذبهاي خوانده شده (O.D)
نمودار 3-2- منحني استاندارد پرولين
3-9- سنجش هاي آنزيمي
3-9-1- سنجش فعاليت آنزيم کاتالاز (CAT)
بررسي ميزان فعاليت کاتالاز با مطالعه کاهش مقدار H_2 O_2 در 240 نانومتر براي يک دقيقه انجام شد. مخلوط واکنش شامل بافر فسفات پتاسيم 100 ميلي مولار (7= pH) و H_2 O_2 15 ميلي مولار و 50 ميکروليتر عصاره آنزيمي در يک حجم 3 ميلي ليتر بود. ميزان فعاليت آنزيم با استفاده از ضريب خاموشي معادله mM^(-1) cm^(-1) 4/39 محاسبه و برحسب يک واحد (ميکرومول پراکسيد هيدروژن مصرف شده در دقيقه) به ازاي ميلي گرم پروتئين بيان گرديد (Aebi, 1984).
3-9-2- سنجش فعاليت آنزيم گاياکول پراکسيداز(GPX)
فعاليت آنزيم پراکسيداز براساس روش Polle و همکاران (1994) اندازه گيري شد. در اين روش 3 ميلي ليتر مخلوط واکنش حاوي بافر فسفات پتاسيم 100 ميلي مولار (7= pH)، گاياکول 20 ميلي مولار، H_2 O_2 10 ميلي مولار و 50 ميکروليتر عصاره آنزيمي بود. افزايش جذب به دليل اکسيداسيون گاياکول در طول موج 470 نانومتر به مدت 3 دقيقه اندازه گيري شد. در نهايت فعاليت آنزيم پراکسيداز با استفاده از ضريب خاموشي معادله mM^(-1) cm^(-1) 6/26 محاسبه و برحسب يک واحد (ميکرومول تتراگاياکول توليد شده در دقيقه) به ازاي ميلي گرم پروتئين بيان گرديد.
3-9-3- سنجش فعاليت آنزيم آسکوربات پراکسيداز (APX)
فعاليت اين آنزيم براساس روش Nakano و Asada (1981) اندازه گيري شد. در اين روش مخلوط واکنش حاوي بافر فسفات پتاسيم 50 ميلي مولار (7= pH)، آسکوربات 5/0 ميلي مولار، آب اکسيژنه 1/0 ميلي مولار و 150 ميکروليتر عصاره آنزيمي بود. فعاليت آسکوربات پراکسيداز براساس اکسيداسيون اسيد آسکوربيک و کاهش در جذب در طول موج 290 نانومتر به مدت 1 دقيقه اندازه گيري شد. يک واحد فعاليت آنزيمي به عنوان مقدار آنزيمي است که 1 ميکرومول آسکوربيک اسيد را در مدت يک دقيقه اکسيد کند. در اين روش براي محاسبه غلظت آسکوربات مصرف شده از منحني استاندارد آسکوربات استفاده شد و به ازاي ميلي گرم پروتئين بيان گرديد.
رسم منحني استاندارد آسکوربات:
براي رسم منحني استاندارد غلظت هاي 1-01/0 ميلي مولار آسکوربات تهيه و جذب آن در طول موج 290 نانومتر خوانده شد و منحني جذب بر حسب غلظت رسم و معادله خطي آن محاسبه گرديد. با استفاده از اين معادله خطي غلظت آسکوربات اکسيد شده در واکنش محاسبه شد.
نمودار
