دانلود تحقیق با موضوع ميلي، ميلي‌ليتر، سديم

دانلود پایان نامه ارشد

3-3- منحني استاندارد آسکوربات پراکسيداز
3-9-4- سنجش فعاليت آنزيم پلي فنل اکسيداز (PPO)
اندازه گيري اين آنزيم به روش ريموند (Raymond) و همکاران (1993) انجام گرفت. ابتدا تعدادي لوله آزمايش در حمام آب 40 درجه سانتيگراد قرار داده شد و سپس به هر لوله 5/2 ميلي ليتر بافر فسفات 2/0 مولار با pH برابر 8/6 افزوده شده سپس به آن 2/0 ميلي ليتر پيروگالل 02/0 مولار اضافه شد و اجازه داده شد تا دماي لوله ها به 40 درجه سانتيگراد برسد. سپس به هر لوله 2/0 ميلي ليتر عصاره آنزيمي افزوده شد و تغييرات جذب در طول موج 430 نانومتر در فاصله زماني 4 دقيقه ثبت گرديد. ميزان فعاليت آنزيم بر اساس تغييرات جذب در 430 نانومتر در دقيقه (Unit) در ميلي گرم پروتئين بيان گرديد.

3-9-5- سنجش فعاليت آنزيم سوپراکسيد ديسموتاز (SOD)
فعاليت آنزيم سوپراکسيد ديسموتاز براساس روش Giannopolitis و همکارانش (1977) اندازه گيري شد. در اين روش بازدارندگي آنزيم SOD از احيا نوري نيتروبلوتترازوليوم (NBT)، اساس اندازه گيري فعاليت اين آنزيم است. براساس اين روش 3 ميلي ليتر مخلوط واکنش حاوي بافر فسفات پتاسيم 50 ميلي مولار (8/7= pH)، متيونين 13 ميلي مولار، نيتروبلوتترازوليوم 75 ميکورمولار، ريبوفلاوين 20 ميکرومولار، EDTA 1/0 ميلي مولار و 100 ميکروليتر عصاره آنزيمي بود. واکنش با برداشتن فويل آلومينيومي و قرار دادن نمونه ها در مقابل نور (LUX 5000) شروع مي شود. پس از 15 دقيقه نور قطع شده و بلافاصله جذب نمونه ها در 560 نانومتر خوانده شد. در اين آزمايش دو نمونه شاهد مورد استفاده قرار مي گيرد که هر دو بدون عصاره آنزيمي بوده، نمونه اول بدون دريافت نور و نمونه دوم 15 دقيقه در مقابل منبع نوري قرار مي گيرد.
يک واحد فعاليت آنزيمي مقداري از آنزيم است که موجب 50 درصد ممانعت احياي NBT در 560 نانومتر مي شود. ميزان فعاليت آنزيم برحسب يک واحد در دقيقه به ازاي ميلي گرم پروتئين محاسبه گرديد.

3-10- سنجش پروتئين‌ها (Lowry et al, 1951):
الف) براي تهيه معرف‌هاي موردنياز بافر تريس به منظور سنجش پروتئين‌ها به صورت زير عمل مي‌نماييم.
1) معرف A : ابتدا 2 گرم سود در 100 ميلي‌ليتر آب مقطر حل شده (سود 5/0 نرمال) سپس
10 گرم كربنات سديم توزين و به سود 5/0 نرمال تهيه شده اضافه گرديد. به اين ترتيب معرف A كربنات سديم 10% حاصل گرديد.
2) معرف B : مقدار يك گرم سولفات مس آبدار CuSo4,5H2o توزين و حجم آن با آب مقطر به 100 ميلي‌ليتر رسانده شد به اين ترتيب معرف B ، سولفات مس 1% بدست آمد.
3) معرف C : براي تهيه آن مقدار 2 گرم تارتارات سديم- پتاسيم در مقداري آب حل شده و حجم آن با آب مقطر به 100 ميلي‌ليتر رسانده شد به اين ترتيب معرف C‌ سديم پتاسيم تاراتارات 2% حاصل گرديد.
4) معرف D : براي تهيه اين معرف به ترتيب مقادير 10، 5/0 و 5/0 ميلي‌ليتر از معرف‌هاي A ، B ، C با يكديگر مخلوط گرديدند.
5) معرف E : از فولين2 نرمال رقيق شده با آب مقطر با نسبت 10، استفاده شد. معرف‌هاي D ، E به صورت تازه در هنگام آزمايش تهيه شدند.
6) بافر تريس: از مخلوط كردن 50 ميلي‌ليتر تريس 2/0 نرمال، 8/26 ميلي‌ليتر اسيد كلريدريك
2/0 نرمال، 2/17 گرم ساكارز، 1/0 گرم اسيد اسكوربيك و 1/0 گرم كلروسيستئين در حجم نهايي
100 ميلي‌ليتر با آب مقطر بدست آمد. pH محلول در 8 تنظيم شد.
ب) انجام آزمايش:
1) 2/0 گرم ماده خشك گياهي را در يك هاون چيني به وسيله 5/0 ميلي‌ليتر بافر تريس به خوبي سائيده شد و سپس محتويات به درون لوله سانتريفوژ منتقل گرديد و هاون چيني با 5/0 ميلي‌ليتر ديگر از بافر تريس شسته شده و به لوله سانتريفوژ منتقل گرديد.
2) با استفاده از دستگاه سانتريفوژ با دور g5000 گرم به مدت 40 دقيقه، لوله‌ها سانتريفوژ شده تا عمل جداسازي انجام گيرد. سپس بخش رويي به منظور استخراج پروتئين‌ها به يك لوله آزمايش منتقل شد.
3) در اين مرحله 50 ميكروليتر از محلول رويي هر نمونه برداشته شده و در يك لوله آزمايش ديگر به روي آن 950 ميكروليتر آب مقطر اضافه گرديد (لوله شماره 1).
4) در يك لوله آزمايش ديگر (لوله شماره 2) به عنوان شاهد مقدار يك ميلي‌ليتر آب مقطر و بعد داخل هر دو لوله يك ميلي‌ليتر از معرف D تهيه شده اضافه گرديد و سپس به مدت 15 دقيقه در دماي آزمايشگاه قرار گرفتند.
5) پس از آن به هريك از دو لوله، مقدار 3 ميلي‌ليتر معرف E اضافه و به شدت تكان داده شد.
6) در نهايت لوله‌هاي مذكور به مدت 10 دقيقه در بن‌ماري و در حرارت 40 درجه سانتيگراد قرار گرفته و پس از خارج كردن از بن‌ماري 20 دقيقه در دماي آزمايشگاه قرار داده شدند.
7) سپس با سرد كردن تدريجي لوله‌ها، به وسيله اسپكتروفتومتر جذب نوري نمونه‌ها در طول موج 750 نانومتر در مقابل شاهد دستگاه خوانده شد.
8) براي محاسبه غلظت پروتئين‌هاي مجهول از معادله حاصل از منحني استاندارد پروتئين سرم آلبومين گاوي با تراكم‌هاي 0، 10، 20، 40، 60 و 80 ميلي‌گرم در ليتر استفاده شد و مقدار جذب در طول موج 750 نانومتر بدست آمد. سپس با استفاده از روش‌هاي آماري معادله 97/0=y تعيين و منحني جذب برحسب غلظت رسم گرديد و براساس آن مقادير كل نمونه‌ها ارزيابي شد.
B-K × ABC = C
C = غلظت پروتئين كه برحسب ميلي‌گرم بر گرم وزن خشك بيان مي‌شود.
K‌ = شيب خط كه مقدار آن برابر 3498/0 است.
ABS = ميزان جذب در طول موج 750 نانومتر
B = عدد ثابت كه مقدار آن برابر 69% است.

نمودار 3-4- منحني استاندارد پروتئين
3-11- سنجش عناصر:
نمونه هاي گياهي (ريشه يا اندام هوايي) که با آب مقطر بدون يون شسته شده و در درون آون در دماي ?70 به مدت 48 ساعت خشک شده بودند، براي سنجش عناصر مورد استفاده قرار گرفتند. عمل هضم و عصاره گيري نمونه هاي پودر شده با کمک مخلوط اسيدي HCl: HNO_3 (V/V 1: 5) انجام پذيرفت (6 ميلي ليتر از مخلوط اسيدي به ازاي 1/0 گرم ماده خشک). نمونه هاي آماده شده در حمام آبي ?95 به مدت 5 ساعت انکوبه شدند. پس از سرد شدن محلول هاي حاصله با کمک ارلن و پمپ خلاء و کاغذ واتمن شماره 2 صاف و در بالن ژوژه 50 ميلي ليتري با آب بدون يون به حجم رسانده شدند (Sagner et al., 1998). غلظت کلسيم، منيزيوم، آهن، پتاسيم، نيتروژن و فسفر در نمونه هاي آماده شده سنجيده شد. غلظت نهايي عناصر مورد بررسي براساس DW mg g^(-1) گزارش شد.
الف- اندازه گيري مقدار کلسيم، منيزيوم و آهن:
سنجش مقدار کلسيم (Ca)، منيزيوم (Mg) و آهن (Fe) با کمک استانداردهاي مربوطه به وسيله اسپکتروسکوپي جذب اتمي (Atomic Absorbtion Varian, Spectr AA-200) انجام شد.
ب- اندازه گيري پتاسيم:
اندازه گيري مقدار پتاسيم نمونه هاي آماده شده با کمک منحني استاندارد به وسيله فليم فتومتر (Flame Photometer, model 410, Sherwood Company) انجام پذيرفت.
اندازه گيري مقدار ازت (N) و فسفر (P) با کمک استانداردهاي مربوطه به وسيله اسپکتروفتومتر (UV-120-01, Shimadzu) به شرح زير انجام پذيرفت:
ج- سنجش نيتروژن کل:
سنجش نيتروژن کل به روش Weatherburn (1967) انجام شد. يون آمونيوم در محيط قليايي در حضور هيپوکلريت سديم با فنل رنگ آبي مي دهد که مربوط به تشکيل يک اندوفنل است. سيترات سديم جهت جلوگيري از تشکيل رسوب به کار مي رود.
معرف هاي مورد نياز:
فنل در الکل، 25 گرم فنل خشک در 100 ميلي ليتر الکل اتيليک 96 درصد (Merck) حل شد.
سديم سيترات- سود، 75/2 گرم سديم سيترات در 200 ميلي ليتر آب مقطر تا جوشيدن کامل حل شد. سپس 5 ميلي ليتر سود 200 گرم در ليتر به آن افزوده و محلول گرم براي خروج مقادير ناچيز آمونيوم احتمالي هوادهي شد.
سود خالص، 200 گرم NaOH را در 750 ميلي ليتر آب مقطر حل کرده و به حجم يک ليتر رسانده شد.
هيپوکلريت سديم 06/0 نرمال، مقدار 6/44 ميلي ليتر از محلول 10% هيپوکلريت سديم (Merck) با آب مقطر به حجم يک ليتر رسانده شد.
روش سنجش:
به 1/0 ميلي ليتر از عصاره هاي حاوي عناصر، 2 ميلي ليتر سديم سترات- سود، 8/0 ميلي ليتر فنل در الکل و 6/1 ميلي ليتر هيپوکلريت سديم افزوده و با آب بدون يون به حجم 10 ميلي ليتر رسانده شد. جذب نمونه ها بعد از 10 دقيقه در طول موج 625 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه گيري شد. براي تخمين غلظت نيتروژن کل بايد محلول هاي استاندارد نيتروژن تهيه نمود. به همين جهت محلول هايي با غلظت هاي مختلف نيتروژن با استفاده از محلول 0476/0 گرم در ليتر سولفات آمونيوم (100 ميلي گرم بر ليتر ازت) تهيه و تمام مراحل انجام شده بر نمونه هاي مجهول در مورد آنها نيز صورت پذيرفت. غلظت نهايي نيتروژن هر يک از محلول هاي استاندارد 0، 2/0، 4/0، 8/0 و 1 ميلي گرم بر ليتر بود.
پس از خواندن ميزان جذب هر محلول در 625 نانومتر، منحني استاندارد براساس ميزان جذب در برابر غلظت رسم گرديد و غلظت نيتروژن نمونه هاي مجهول محاسبه و براساس DW mg g^(-1) بيان شد.
د- سنجش فسفر:
به منظور سنجش فسفر از روش Kitson & Mellon (1944) استفاده شد. وانادات موليبدات و ارتوفسفات در محيط اسيدي مناسب توليد کمپلکس زرد رنگي مي نمايد که در طول موج 450 نانومتر مقدار جذب رنگ توليد شده متناسب با غلظت ارتوفسفات مي باشد.
طرز تهيه معرف بارتن:
5/22 گرم آمونيوم موليبدات [(NH_4 )_4 MO_7 O_4.4H_2 O] در 400 ميلي ليتر آب مقطر گرم حل شد.
25/1 گرم آمونيوم وانادات [NH_4 VO_3] به طور جداگانه در 300 ميلي ليتر آب دو بار تقطير گرم حل شد.
پس از سرد شدن اين دو محلول، ابتدا آمونيوم وانادات و سپس آمونيم موليبدات به 250 ميلي ليتر اسيد نيتريک غليظ افزوده شده و محلول حاصل با آب فاقد يون به حجم 1000 ميلي ليتر رسانده شد.

روش سنجش:
به 1 ميلي ليتر از عصاره هضم شده، 1 ميلي ليتر معرف بارتن و 3 ميلي ليتر آب مقطر بدون يون اضافه گرديد و محلول حاصل بلافاصله با ورتکس به شدت هم زده شد. پس از 10 دقيقه، جذب نمونه ها با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 450 نانومتر خوانده شد.
جهت رسم منحني استاندارد با استفاده از دي هيدروژن فسفات پتاسيم [KH_2 PO_4] محلول پايه 100 ميلي گرم بر ليتر فسفر تهيه شد و با استفاده از آن محلول هايي با غلظت هاي مختلف فسفر به دست آمد. مراحل انجام شده بر نمونه هاي مجهول در مورد آنها نيز صورت پذيرفت. غلظت نهايي فسفر هر يک از محلول هاي استاندارد 1، 2، 3، 4، 5 و 6 ميلي گرم بر ليتر بود. پس از خواندن جذب هر محلول، منحني استاندارد براساس ميزان جذب در برابر غلظت رسم گرديد و غلظت فسفر در نمونه هاي مجهول محاسبه و براساس واحد DW mg g^(-1) بيان گرديد.

3-12- مطالعه پروتئين ها به روش الکتروفورز:
تمام پروتئين ها در pH غير از نقطه ايزوالکتريک1 خود باردار هستند و لذا وقتي در يک ميدان الکتريکي قرار مي گيرند حرکت مي کنند. از محيطهاي مختلف نظير آگارز، نشاسته، استات سلولز و پلي آکريل آميد براي تفکيک پروتئين ها استفاده مي شود اما قدرت بيشتر ژل هاي پلي آکريل آميد موجب شده که آنها استفاده ي عمومي تري پيدا کنند.
الکتروفورز بر روي ژل آکريل آميد، مولکول ها را در مخلوطهاي پيچيده براساس اندازه و ميزان بار الکتريکي تفکيک مي کند. در طي الکتروفورز يک ميان کنش بين نمونه ها، بافري هاي مخلوط ژل و جريان الکتريکي صورت مي گيرد که منجر به تفکيک بافرهاي پروتئيني داراي مولکول ها تفکيک شده مي شود. برحسب تنوع هايي که ممکن است وجود داشته باشد بايد اندازه منافذ ژل، سيستم هاي بافري ويژگي هايي مولکول هاي مورد نظر را در الکتروفورز در نظر داشت.
الف- اندازه ي منافذ ژل: منافذ ژل در نتيجه اتصالات بين پلي آکريل آميد و بيس اکريل آميد به وجود مي آيد که منجر به تشکيل يک شبکه از منافذ مي شود. اين ساختار امکان غربال شدن مولکول ها را از ميان ماتريکس ژل فراهم مي کند. اندازه ي منافذ ژل بستگي به غلظت مونومرهاي آکريل آميد به کار رفته دارد. به طوري که با افزايش غلظت اندازه منافذ ژل کاهش مي

پایان نامه
Previous Entries دانلود تحقیق با موضوع ميلي، ميلي‌ليتر، منحني Next Entries پایان نامه با واژگان کلیدی آزمون فرضیه، سرمایه در گردش، مدیریت سرمایه