تحقیق رایگان درباره کادميوم، سلولهاي، باکتريهاي

دانلود پایان نامه ارشد

برداشتن کادميوم از محلول آبي طراحي شدهاند. ابتدا آزمايشات جذب جهت ارزيابي ظرفيت جذب کادميوم انجام پذيرفت. نتيجه 2 ساعت انکوباسيون سلولهاي باکتري E .coli نمايش دهنده موتيف جاذب کادميوم در سطح با محلولهاي حاوي غلظت هاي متفاوت کادميوم در شکل(3-29) نشان داده شدهاست. همچنانکه که ملاحظه مي شود ميزان جذب کادميوم با افزايش غلظت کادميوم در محلول افزايش يافته و در حدود 2 ماکرومول براي کنترل مثبت 8 ماکرومول براي نمونههاي جهش يافته به ازاي يک گرم وزن خشک باکتري بتعادل ميرسد سپس افزايش جذب بکندي پيش مي رود. آزمايشات مشابهي براي بدست آوردن ظرفيت ساير يونهاي فلزي يعني، نيکل، مس و کروم نيز بطور جداگانهاي بر روي باکتريهاي کنترل (بيان کننده CS3 بدون دست ورزي) انجام گرفت که به ترتيب مقادير 9، 12 و9.2 ميلي گرم به ازاي يک گرم وزن تر باکتري بدست آمد. لازم به ذکر است آزمايش مشابهي بر روي باکتريهاي جهش يافته انجام گرفت که در آنها غلظت تعادلي براي سه عنصر نيکل، مس و کروم بسيار پايين تر از کنترل بود.

شکل 3- 29. منحني ظرفيت جذب کادميوم در باکتري بيان کننده موتيف اتصالي به کادميوم و باکتري E. coli ميزبان. سلولهاي ميزبان سلولهاي pPM4567 ميباشند.

ب ) سينتيک جذب:
براي تعيين سرعت جذب کادميوم توسط سلولهاي باکتري تغييريافته ژنتيکي،آزمايش وابسته به زمان براي اين دسته از سلولها و نيز سلولهاي بيان کننده پيلي طبيعي E. coli ( بعنوان کنترل) در حضور کادميوم با غلظت 16µM از آن فلز انجام گرفت. همانطور که در شکل(3-30) نشانداده شدهاست ، بالاترين بازده جذب کادميوم در 15 دقيقه ابتداي آزمايش صورت ميگيرد در اين محدوده زماني همچنين بيشترين اختلاف جذب بين باکتري هاي تغييريافته ژنتيکي و باکتريهاي کنترل وجود دارد. فرايند جذب را بدين ترتيب ميتوان تشريح کرد که بعد از يک مرحله جذب سريع، کارايي جذب تنزل يافته وحدود 2 ساعت بعد از شروع واکنش به تعادل ميرسد. نکته حائز اهميت اينکه پس از حداکثر جذب کاهش قابل توجهي در منحني جذب باکترهاي مهندسي شده نسبت به باکتريهاي کنترل ديده ميشود که ممکن است بعلت آشفتگي و آشوبناشي از مخلوط کردن سيستم در انکوباتور چرخش دارباشد که اثر آن در باکتريهاي مهندسي شده مشهودتر از باکتريهاي کنترل (بدون دستورزي) ميباشد. توجيه ديگر براي اين مسئله مي تواند اين ميباشد که تعداد پيليها در سطح باکتريهاي مهندسيشده کمتر از باکتريهاي کنترل ميباشد بهمين دليل اثر از دست دادن تعداد اندکي پيلي در اين دسته از باکتريها خيلي سريع در نتيجه مشاهده ميگردد.

شکل3-30. بررسي اثر عامل زمان بر جذب کادميوم در باکتريهاي مهندسي شده. نمونه مهندسي شده مورد استفاده در اين منحني pEYS38cb?m2 و سلولهاي ميزبان نيز سلولهاي pPM4567 ميباشند. غلظت محلول کادميوم استفاده شده 16 µM ميباشد

1-6-2-3 جذب کادميم
فلزات معمولا بصورت نمک در طبيعت وجود داشته و در آب محلول مي¬باشند و به صورت يونهاي فلزي توسط باکتريها جذب ميشوند. ولي از آنجائيکه در محيط هيپوتونيک ممکن است باکتريها دچار تورژسانس و ليز شوند لذا پس از بررسي منابع مختلف از لحاظ حلاليت نمک فلزات و تست اکثر آنهاTris-HCl 1mM (pH 7.4) به عنوان حلال مناسب براي حل کردن فلزات انتخاب گرديد. پس از انتخاب نوع حلال، غلظت کاري بر اساس بررسي جذب در طيف غلظتهاي کادميوم که از µM7 شروع شده و به µM 35 ختم ميگرديد، انجامپذيرفت(شکل3-31).
براي بررسي و مقايسه توانايي باکتريهاي نوترکيب مختلف در اتصال به يونهاي فلز سنگين،ابتدا کلونهاي نوترکيب (pPEYS38cbm2, pPEYS38cb?m2 ,pPEYS66cbm2 ,pPEYS79cbm2 ,pPEYS79cb?m2 , ،pPEYS92cbm2, pPEYS107m2 ,pPEYS107cb?m2) روي محيط CFA آگار حاوي آنتيبيوتيک آمپيسيلين و نمونههاي کنترل مثبت pPM4567 روي محيط CFA آگار حاوي آنتيبيوتيک کلرامفنيکل به مدت 20 ساعت کشت شدند. بعد از جمعآوري باکتريها از روي سطح پليت و دوبار شستشو با بافر Tris-HCl 1mM (pH 7.4)، سلولها توسط سانتريفوژ با دور 5000 الي 7000 رسوب دادهشدند و پس از خشک شدن بصورت شبانه در آون °C 105 و حل کردن در اسيدنيتريک، ميزان کادميوم بوسيله دستگاه جذب اتمي اسپکتروفتومتر اندازه گيري شد (شکل 3-27). همچنانکه ملاحظه مي شود سلولهاي بيانکننده پيليهاي هيبريد در مقايسه با سلولهاي کنترل (سلولهاي بيان کننده پيلي طبيعي) مقدار کادميم بيشتري را جمع کردهاند. ميزان جذب کادميوم در سلولهاي بيان کننده پيلي نوترکيب 33/11 تا 9 /13 برابر سلولهاي بيان کننده پيلي بدون دستورزي مي¬باشد. بنابراين اين نتايج بوضوح نشان ميدهد که حضور موتيف و بتاموتيف توانايي سويه DH5? براي جمعآوري يونهاي کادميوم را به ميزان قابل توجهي افزايش ميدهد.

شکل 3-31. مقايسه جذب کادميوم در سلولهاي کنترل و سلولهاي نوترکيب. سلولهاي کنترل (pPM4567) بيان کننده پيلي طبيعي و سلولهاي نوترکيب بيان کننده پيلي نوترکيب مي¬باشند.
2-6-2-3 اختصاصيت اتصال
جهت ارزيابي اختصاصيت جذب موتيف هاي طراحي شده نسبت به کادميوم ، ميزان جذب کادميوم سلولهاي باکتري در حضور فلزات ديگر(2+ Cu2+,Ni وCr2+) نيز بررسي شد. روش آزمايش همانند جذب کادميوم به تنهايي بود با اين تفاوت که اينبار به جاي کادميوم به تنهايي مخلوط نمک فلزات کادميوم، کروم، نيکل و مس با غلظتهاي به ترتيب 12،23، 20 و 18 ماکرومول اضافه گرديد همچنانکه در جدول3-4 ملاحظه ميگردد سلولهاي مهندسي شده ميزان کادميم بيشتري را نسبت به سلولهاي کنترل در حضور ساير فلزات جذب مينمايند. با اين حال ظرفيت جذب کادميوم در حضور ساير فلزات کاهش مييابد، که نشان ميدهد حضور ساير فلزات اثر بازدارندگي بر جذب کادميوم دارد و اين اثر بازدارندگي در سلولهاي کنترل نسبت به سلولهاي مهندسي شده مشهودتر ميباشد (جدول3-4).

جدول 3- 4. اثر رقابتي يونهاي Ni2+ ,Cu2+ و Cr3+ بر جذب کادميوم در حضور کادميوم.
سلولهاي بيان کننده پيلي

مقدار فلز جذب شده بر حسب نانومول به ازاي يک ميلي گرم وزن خشک باکتري
(nmol/mg of cells [dry wt])

Cd2+

Ni2+

Cr2+

Cu2+
pEYS38cbm2
24.452±2.72
NDa
ND
ND

pEYS38cb?m2
20.56±2.08
6.729±0.88
48.1908±- b
40.8923±8.95

pEYS66cbm2
19.876±4.29

10.0932±2.56
ND

pEYS79cbm2
22.2504±3.36616

ND
ND
47.318 ±8.08

pEYS79cb?m2
19.6256± 3.0724

ND
ND
ND
pEYS92cbm2
19.8984 ± 1.3388

ND
30.64 ±-
-c
pEYS107cbm2
23.4488 ± 4.72152

ND
19.656 ±-
28.72 ± 5.04

pEYS107cb?m2
16.94384 ± 4.29432

ND
34.28 ±-
31.12 ±5.29
pPM4567(Control)
0.3251± 0.24
2.5233±0.38
20.5314±-
22.8295±1.77
aND, not detectable
b-, not etermined

1-4 مزيت بيان سطحي بر ساير سيستمهاي بيان پروتئين
آلودگي به سبب مواد شيميايي از جمله فلزات سنگين بحراني است که نتايج بسيار مخرب بر روي بيوسفر داشته است. فراوانترين آلاينده ها در فاضلاب ها و پسماندها، فلزات سنگين مي باشند. فعاليت هاي انساني مانند استخراج معادن و دفع پسماندهاي صنعتي منجر به تجمع فلزات در محيط و سرانجام در زنجيره غذايي شده و مشکلات بهداشتي و اکولوژيکي فراواني را بوجود آوردهاست. بنابراين حذف فلزات سنگين از فاضلاب ها و چرخه حيات موضوع مهمي در بهداشت عمومي محسوب ميشود. روشهايي مانند رسوبدهي، فيلتراسيون و اکسيداسيون و احيا از جمله روشهاي متداول در حذف فلزات سنگين از پسابها هستند ولي اين روشها توانائي لازم جهت کاهش آلايندهها تا سطح قابل قبول ازلحاظ بهداشتي را ندارند. مطالعات مختلف نشاندادهاست که روشهاي زيستي ميتواند شرايط اقتصادي و کارآمدتري را در مقايسه با بسياري از روشهاي فيزيکوشيميايي فراهمکند. لذا استفاده از عوامل زيستي براي حذف (و نيز باز يافت آنها) از آبهاي آلوده سالهاست که مورد بررسي قرارگرفته و طي سالهاي اخير کاربرد تکنولوژي ميکروبي و نيزتوسعه جاذبهاي فلزي با تمايل و قدرت انتخاب بالا جهت حذف فلزات سنگين از محيطهاي آلوده مورد توجه قرارگرفتهاست.(Kurodaet al., 2010 Wernerus et al., 2004,) مهندسي ژنتيک ميکروبهاي بيان کننده پروتئينهاي جاذب فلزات سنگين افق جديدي را در تحقيقات حذف زيستي گشودهاست.
بيان داخلي و پريپلاسمي پپتيدهاي جاذب فلزات در ميکروبهاي تراريخت هرچند باعث افزايش خاصيت جذب فلز در باکتري شدهاست، اما بيان داخل سلولي اين پروتئينها و پپتيدها در باکتريها با مشکلاتي مانند کاهش استفاده مجدد103 از جاذبهاي زيستي (به سبب رهايي و آزادسازي کند و آهسته فلزات تجمعيافته) و نيز تداخل پروتئينهاي غني از سيتئين با سيستمهاي اکسيداسيون و احياي موجود در سلولهاي ميکروبي و در نتيجه مرگ سلول، مواجه بودهاست. لذا ميبايست روشهاي ديگري جهت استفاده ميکروبي اتخاذکرد (Bae et al., 2000, Kotrba et al., 1999b, Kuroda et al., 2010)
بيان سطحي ميکروبي امکان بيان پروتئينهاي کارا و فعال را روي سطح ميکروبها امکان پذير ساختهاست و از زمان گزارش اولين سيستم عرضه سطحي در اواسط 1980، انواعي از سيستمهاي جديد براي عرضه باکتريايي گرم منفي و گرم مثبت و مخمرها گزارش شدهاست. مهندسي سطح سلول به عنوان يک فناوري جديد با کاربردهاي بالقوه در واکسنهاي زنده، کنترل زيستي پاتوژنها، توسعه و بهبود بيوکاتاليستها و غربالگري کتابخانههاي پپتيدي مورد توجه قرار گرفتهاست و در دهههاي اخير، بيان سطحي پروتئينهاي هترولوگ جهت افزايش جذب آلايندههاي شيميايي و بخصوص حذف فلزات سنگين حوزه جديد و پرطرفداري را در تحقيقات زيستي بوجود آوردهاست (Kuroda et al., 2010, Bae et al., 2000, Qin et al., 2006)

2-4 کاربرد پيلي CS3 جهت نمايش سطحي و نقش مطالعات بيوانفورماتيکي در شناسايي مناطق مجاز ورود پپتيدهاي بيگانه در آن
انواع مختلفي از تاژک‌ها بخصوص در باکتريهاي گرم منفي شناسايي شده‌است. پيلي‌ها ارگانل‌هاي اتصالي باکتريها هستند که آنها را قادر ميسازد به بافتهاي خاص ميزبان متصل‌شوند. اين ساختارهاي نخ مانند طويل به تعداد زيادي در سطح سلول وجود دارد .(Hedegaard et al., 1989) ساختار يک فيمبريه شامل صدها زيرواحد يکسان و اصلي است که بطور عمده از طريق اندرکنش اسيدهاي آمينه انتهاي آميني و کربوکسيلي روي هم قرارگرفته و پيلي بيشکل را بوجود ميآوردند ( (Schembri et al., 2000a, Schembri et al., 2000b, Soto et al., 1999 (شکل1-7).
در باکتريهاي گرم منفي پروتئينهاي غشاي خارجي و ارگانلهاي پليمري سطحي يعني تاژک و پيلي بيشترين تحقيقات و کاربرد را متوجه خود نمودهاند. بيان قطعات پپتيدي روي سطح باکتريهاي گرم منفي کاربردهاي هيجان انگيزي براي آنها در زيست فناوري، کاربردها و تحقيقات داروسازي و پزشکي، رقم زدهاست. سيستمهاي بياني بر پايه تاژکها و پيليها داراي امتيازاتي نسبت به ساير سيستمهاي پروتئيني غشاي خارجي هستند که از آنجمله ميتوان موارد زير را برشمرد. (1) پيليها به تعداد زيادي در حدود نيم ميليون در سطح سلول بيان مي شوند از اينرو زماني که عرضه سطحي با ظرفيت بالا مورد نياز است، هيچکدام از سيستم هاي باکتريايي توانايي رقابت با سيستم هاي پيلي و فلاژل را ندارند، (2) آنها ايمونوژن هاي قوي ميباشند، (3) پيليها داراي خاصيت چسبندگي هستند و ميتوانند باکتريها را برروي سطوح تثبيت نمايند و (4) مهمتراينکه برخلاف ساير سيستمهاي غشاي خارجي، براحتي ميتوان پيليها را از سطح باکتري جدا و خالص کرد. تاکنون بيشترين استفاده از ارائه پپتيدي جهت توسعه واکسنهاي نوترکيب بوده است. با اين حال پتانسيل بکارگيري اين تکنولوژي براي توسعه و ساير کاربردها مانند ساخت کتابخانه تصادفي و يا در جهت ساخت و توليد کاتاليستها و نيز جاذبهاي زيستي وجوددارد.
اگرچه انواع مختلف و متنوعي از تواليهاي هترولوگ در پيليها ارائه شدهاند ولي محدويتهايي نيز در استفاده از اين ساختارها در ارتباط با اندازه و ترکيب پپتيدهاي ورودي وجود دارد که شامل (1) پپتيدهاي ارائه شده ميبايست ترجيحا

پایان نامه
Previous Entries پایان نامه با واژه های کلیدی هدف گذاری، دینامیکی Next Entries پایان نامه با واژه های کلیدی هزینه سرمایه، برنامه ریزی خطی، دوره بازگشت