تحقیق رایگان درباره پيلي، CS3، زيرواحد

دانلود پایان نامه ارشد

ساختارهاي مارپيچي با دو زيرواحد در هر پيچ (فيبريلهاي نازک و قابل انعطاف) سازمان يابند و يا ممکن است فيبرهاي بصورت ساختارهاي مارپيچي با 3 الي 4/3 زيرواحد در هر پيچ (فيبريلهاي ضخيم و شکننده) سازمان يابند. همچنين ممکن است ساختارهاي بيشکل و غيررشتهاي (کپسولي شکل) را در سطح سلول تشکيل دهند که ميتوان به ساختار پيلي CS3 در باکتري E. coli و آنتيژن F1 غشايي در باکتري Yersinia pestis اشاره نمود.
زيرواحدهاي اصلي کپسول F1 که Caf1 ناميده ميشود از طريق مسير حفاظت شده چاپرون /آشر(CU/pathways) مونتاژ شده و ساختار بيشکل کپسول را بوجود ميآورد. مطالعات ساختاري و عملکردي کمپلکسهاي Caf1M-Caf1 و Caf1-Caf1 نشان داد که تشکيل اين کمپلکسها با سازکار تشکيل پيلي CS3 يکسان ميباشد (جدول1-4). لذا بنظر ميرسد اطلاعات بدست آمده و همچنين اطلاعات موجود در زمينه اتصالات ساختاري زيرواحدهاي کپسول F1 قابل تعميم به پيلي CS3 ميباشد(Nuccio and Baumler, 2007, Sauer et al., 2000, Sauer et al., 2004, Sauer et al., 2002, Soto and Hultgren, 1999).

الف ب
شکل 1-7. دياگرام شمايتک از سرهمبندي پيلي توسط مسير چاپرون و آشر. (الف) در طي انتقال زيرواحدهاي پيلي از غشاي سيتوپلاسيم (CM)با مسير عمومي ترشحي(Sec) ابتدا پپتيد نشانه انتهايآميني بريده ميشود سپس در پريپلاسم(PP) تاخوردگي شبه ايمونوگلوبوليني زير واحدهاي پيلي با زنجيره دهنده چاپرون (C) کامل ميشود (پيکان مشکي). اندرکنش کمپلکسهاي زيرواحد پيلي/ چاپرون با پروتئين آشر65 (U) موجب تسهيل جابجايي زنجيره دهنده چاپرون با زنجيره انتهايآميني دومين زيرواحد ميشود و بدين ترتيب زيرواحدها به ساختارهاي فيبري سازمان يافته و از غشاي خارجي (OM) عبور داده ميشوند. همچنانکه که در شکل نشان داده شدهاست برخي از فيلامنتها يک راس يا کلاهک چسبنده در انتهاي خود دارند که در اتصال آنها بسيار موثر است. (ب) مکانسيم تشکيل پيلي که تحت عنوان دياگرام تکميل زنجيره دهنده خوانده ميشود: در طي فرايند تشکيل و سوار شدن زير واحدهاي پيلي ابتدا ملکول چاپرون زنجيره G1(زرد) خود را جهت تکميل ساختار Ig زيرواحد پيلي (سفيد) به اشتراک ميگذارد از آنجائيکه اين تاخوردگي به صورت غير مرسوم بوده، زيرا زنجيره G1 در جهت موازي با زنجيره F قرار دارد لذا ساختار حاصل به نام ساختار شبه گلوبوليني ناميده ميشود.سپس انتهايآميني پيلي دوم که در اين شکل بصورت يک زنجيره قرمز رنگ (زنجيرهk) نمايش داده شدهاست با زنجيره دهنده چاپرون معاوضه ميشود که در نتيجه تاخوردگي و تاخوردگي مرسوم ايمونوگلوبيني تشکيل ميشود يعني گسترش انتهايآميني در فرمت ضد موازي قرار ميگيرد و اين فرايند تشکيل ساختار ضدموازي با چاپرون سپس تبديل به ساختار موازي با جانشين شدن زيرواحد بعدي با چاپرون، تا تشکيل پيلي کامل ادامه مييابد(Sauer et al., 2002, Nuccio and Baumler, 2007).

جدول1-4. ارگانلهاي سطحي باکتريايي که از طريق مسير چاپرون-آشر اسمبل ميشوند(Sauer et al., 2000).

1-14-1 پيليهاي باکتريايي و پيلي CS3
پيليها که فيمبريه هم ناميده مي‌شوند، فيبريلهاي شبيه مو به اندازه 004/0تا 008/0 ميکرون هستند. اين ارگانل با ميکروسکوپ الکتروني در سطح باکتريهاي مختلف قابل رويت هستند. آنها مستقيم‌تر، نازکتر و کوتاهتر از فلاژلها ميباشند. اين رشته‌ها در غشاي پلاسمايي سلول باکتريها لنگر مي‌اندازد و به نام اندامکهاي اتصالي نيز ناميده ميشوند زيرا باکتريها را قادر ميسازند به بافتهاي خاص ميزبان متصل‌شوند. انواع مختلفي از فيمبريه‌ها بخصوص در باکتريهاي گرم منفي شناسايي شده‌است. ساختار يک پيلي شامل صدها زيرواحد يکسان و اصلي است که پيلين ناميده ميشود و چند پروتئين کوچک که در اتصال و تجمع پيلي نقش دارند، تشکيل شداست. البته لازم به ذکر است که پروتيئينهاي کمکي در همه پيليها وجود ندارد. زيرواحدهاي اصلي پيلي از اندرکنش انتهايآميني و کربوکسيلي روي هم قرار گرفته و پيلي شکل ميگيرد(Soto and Hultgren, 1999)
زير واحد اصلي پيلي که در ايمنيزايي نيز نقش دارد داراي نواحي بسيار متغير ميباشد. اين نواحي نقاط مناسب براي ورود پپتيدهاي خارجي ميباشند. انواع مختلف پيلي براي کاربرد آن در سيستم نمايش سطحي وجود دارد. در دهههاي اخير طيف وسيعي از پپتيدهاي هترولوگ به طور موفقيت آميز روي پيليهاي مختلف به منظور کاربردهاي بيوتکنولوي، واکسنولوژي و اهداف زيست محيطي نمايش دادهشدهاند. جدول 1-5، خلاصهاي از اپيتوپ و پپتيدهاي نمايش داده شده روي پيليهاي مختلف را نشان ميدهد. (Klemm and Schembri, 2000).
از انواع پيليها ميتوان پيلي P fimbriae باکتري E. coli را نام برد که دو ناحيه بسيار متغير HR1 و4 HR دارد. توالي 8-20 اسيد آمينهاي از اپيتوپ ويروس FMD(Food and mouth disease virus) بدون ايجاد تغيير در بيوژنز پيلي، وارد اين نواحي متغير شدهاست (van Die et al., 1990).
نوع ديگر پيلي، پيلي تيپ I ميباشد. اين نوع پيلي به سلولهايي که داراي واحدهاي مانوز ميباشد، متصل ميشود. پيلي تيپ I داراي دو زيرواحد مهم FimH و FimA ميباشد که به عنوان حامل اپيتوپ خارجي از آنها استفاده شدهاست(Chen and Schifferli, 2000).
پيلي CS3 که بوسيله بسياري از سويههاي اشريشياکلي مولد انتروتوكسين بيان مي‌شود، به عنوان يک سيستم مناسب عرضه سطحي باکتريايي براي نمايش پپتيدهاي هترولوگ استفاده شدهاست. ساختار اين پيلي مانند ساير پيليها شامل صدها زير واحد اصلي و يکسان است که CstH ناميده مي‌شود(Yakhchali and Manning, 1997) و استراتژي بکارگيري آن مشابه ساير پروتئين‌هايي که بدين منظور استفاده مي‌شود، شامل وارد کردن توالي هترولوگ درون محل‌هاي مجاز (مناطق مجاز محلهاي هستند که پپتيدهاي خارجي را،بدون اينکه مداخله‌اي در ساختار و عملکرد پروتئين حامل و پپتيدخارجي داشته باشد، را مي‌پذيرند) و بدين طريق ارائه آن در سطح سلول مي‌باشد(Saffar, 2005, Hedegaard and Klemm, 1989). لذا در برخي از مطالعات از آنها به عنوان حامل مناسبي براي نمايش سطحي باکتريايي پپتيدهاي جاذب فلزات سنگين استفاده شدهاست (Saffar et al., 2007, Saffar, 2005). معهذا ساختارهاي فوق علاوه بر کادميوم فلزات ديگر نظير نيکل، روي و سرب را نيز جذب ميکنند. توسعه و بهبود اين سيستم جهت جذب اختصاصي يا با تمايل اتصال بيشتر به يک فلز به سبب مزايا و کاربردهايي نظير افزايش ظرفيت جذب سيستم در رقابت با عناصر ديگر، ساخت سنسورها و نيز استحصال فلز خالص از پسابهاي صنعتي و معدني جهت استفاده مجدد ازآنها در صنايع از اهميت خاصي برخوردار است.
همچنانکه ذکر شد اسيدهايآمينه ناحيه انتهايآميني و کربوکسيلي زيرواحد اصلي در ساخت پيلي درگير هستند. ولي بقيه مناطق با توجه به ماهيت اسيدهايآمينه آن مي‌تواند در دسترس محيط و يا مخفي از آن باشد که اين مناطق ميتوانند کانديدايي براي مناطق مجاز بشمار روند. لذا بنظر ميرسد آگاهي از مسير آب دوستي پروتئين CstH، ساختار دوم و نيز ساختار سوم زيرواحد CstH براي شناسايي و يافتن مناطقي که بتوانند در سطح پيلي و در دسترس محيط قرار گيرند و پذيراي پپتيد خارجي باشند، بسيار ضروري و سودمند است و امروزه اين اطلاعات توسط ابزارها و روشهاي بيوانفورماتيکي استخراج ميگردند.
لذا در اين مطالعه با بررسي بانک اطلاعاتي، موتيفهاي جاذب کادميوم را استخراج کرده و از طرف ديگر جايگاههاي مجاز پذيرش پپتيد خارجي (Permesive site) ژن CstH (سابيونيت ساختاري پيلي CS3) را به کمک سرورهاي پيشگويي کننده، پيشبيني کرده سپس موتيفهاي فوق الذکر را در هر يک از جايگاههاي مجاز وارد کرده و با ابزارهاي بيوانفورماتيکي امکان در سطح قرار گيري آنها بررسي گرديد تا مناسبترين ساختار براي بررسيهاي آزمايشگاهي66 حاصل گردد. سپس با فنون مهندسي ژنتيک، توالي موتيف مربوطه جهت جذب اختصاصي کادميوم در پيلي CS3 کلون و در سطح باکتري عرضه گرديد.

جدول 1-5. خلاصه اي از اپي توپها و موتيفهاي ارائه شده توسط پيليها:

1-1-14-1 سازمان دهي ژنتيکي اپرون cst
اپرونهاي مسئول بيوسنتز پيليها شناسايي شدهاند. همه اين اپرونها ميزان G+C پاييني دارند و از کدونهاي معمول در ژنهاي باکتريايي کمتر استفاده ميکنند که اين مطلب خود توضيحي بر بيان کمتر اين دسته از ژنها نسبت به ساير ژنهاي باکتريايي است. همچنين اپرونهاي CF انساني بوسيله عناصر انتقالي67 از دو طرف مسدود شدهاند که نشان ميدهد اين ژنها توسط ترانسپوزنها وارد پلاسميدها شدهاند و منشا باکتريايي ندارند(Yakhchali and Manning, 1997, Jalajakumari et al., 1989).
دسته ژن cstA-H مسئول بيوسنتز پيلي CS3است که cstH زيرواحد اصلي و csA-G پروتئينهاي کمکي را سنتز ميکنند (شکل1-8). پروتئين CstH بصورت پيشساز 17 کيلودالتوني سنتز ميشود، سپس طي فرايند پردازش توالي نشانه آن، در دو جايگاه 7 و 22 جدا شده و دو پروتئين 5/15 و 5/14 کيلودالتوني بوجود ميآيد (Yakhchali and Manning, 1997).
ژنهاي کد کننده پيلي CS3 روي پلاسميد قرار گرفته که توالي نوکلئوتيدي آن بطور کامل تعيين شده و با شناسه X16944.1 در پايگاه داده NCBI موجود است. (شکل1-8).

شکل1-8. سازماندهي ژنتيکي لوکوسهاي اپرون CS3، فلشها جهت پروموترها را نشان ميدهد.

2-1-14-1 تنظيم بيان CS3
بيان پيلي CS3 معمولا در دماي 37 صورت ميگيرد و کاهش دماي محيط رشد باکتري، در اغلب موارد از بيان پيلي ميکاهد. ترکيب شيميايي محيط بيان CS3 اختصاصي68 است. البته برخي از پيليها براي بيان نياز به نمکهاي صفراوي دارند. گزارشاتي وجود دارد مبني بر اينکه پيلي CS3 در محيط LB آگار نيز بيان ميشود با اين تفاوت که ميزان بيان در اين محيط تقريبا يک سوم محيط اختصاصي CFA آگار ميباشد (Anantha et al., 2004, Ludi et al., 2006, Favre et al., 2006).
15-1 اهداف تحقيق
در دهههاي اخير ورود آلايندهها با منشاء انساني مانند فلزات سنگين درون اکوسيستم، به مقدار زيادي افزايش يافتهاست كه اين به عنوان يک خطر جدي براي حيات اکوسيستم زمين به شمار ميآيد. فلزات سنگين آلاينده در پساب بسياري از صنايع مانند آبكاري فلزات، عمليات استخراج معدن، دباغي و غيره موجود ميباشند كه از مهمترين آنها: كادميوم، كروم، كبالت، نيكل، سرب، مس و جيوه هستند. فلزات سنگين از نظر زيستي تخريب پذير نيستند لذا تمايل به انباشتگي در بدن موجودات زنده دارند. فلزات سنگين در يک مقياس وسيع، از منابع طبيعي و انسان ساخت وارد محيط زيست ميشوند. تجمع فلزات سنگين در آب، هوا و خاک، يک مشکل زيست محيطي بسيار مهم ميباشد. اولين عامل اثرات آلودگي فلزات در يک اکوسيستم، وجود فلزات سنگين در بيومس يک منطقه آلودهاست كه سلامت انسان را به مخاطره مياندازد. از اين رو پساب حاوي فلزات سمي قبل از اينكه به جريان آبي (رودخانهها) تخليه شود نيازمند تصفيه است. بسياري از روشهاي فيزيكي – شيميايي مانند تعويض يون، جداسازي غشايي و غيره براي تصفيه فلزات دردسترس است. اصليترين عيبي كه اين روشها دارد توليد لجن زياد و هزينه بالا است. پس وجود يك تكنولوژي مقرون به صرفه و دوستدار محيط زيست براي تصفيه فلزات از پساب لازم است. در سالهاي اخير ايجاد يک سيستم نمايش جذب زيستي با قرار دادن موتيف متصل شونده به فلز روي سطح باکتري به عنوان موثرترين روش براي آلودگي زدايي پساب حاوي فلزات سنگين و كاهش سر يع غلظت سموم در پسابها شناخته شدهاست.
در اين تحقيق از پيلي CS3 بعنوان ابزار نمايش سطحي موتيف کادميوم استفاده شد. موتيفهاي کادميوم از پروتئين CadA، ناقل کادميوم در باکتري يرسينا پستيس، استخراج گرديد و در مناطق مجاز پروتئين CS3 وارد شدند و جذب اختصاصي فلزسنگين کادميوم توسط اين سيستم در محيط آزمايشگاه بررسي شدند.

1-2 بررسيهاي بيوانفورماتيکي
1-1-2 پايگاههايداده و برنامههاي بيوانفورماتيکي
پايگاههايداده و برنامههاي بيوانفورماتيکي استفاده شده در اين تحقيق بطور

پایان نامه
Previous Entries تحقیق رایگان درباره عرضه کننده Next Entries پایان نامه با واژه های کلیدی شبیه‌سازی، هدف گذاری، دینامیکی