تحقیق رایگان درباره پلاسميد، نوترکيب، خارجي

دانلود پایان نامه ارشد

پراکنده کرده و درون ميکروفيوژهاي مناسب تقسيمکرده و در منفي 70 درجه سانتيگراد ذخيره شد.

7-5-2 انتقال پلاسميد به درون باکتري86
فرايند انتقال طبق مراحل زير انجام شد:
1- يک ويال حاوي 100 ميکروليتر از سلولهاي مستعد و ويال حاويDNA پلاسميدي مورد نظر روي يخ قرار داده شد تا به دماي صفر درجه سانتيگراد برسد. 5-10 ميکروليتر از DNA پلاسميدي (يا محصول Ligation) به سلولهاي مستعد اضافه شدند.
2- با همزدن آرام توسط سرسمپلر DNA و باکتريها را بخوبي مخلوط کرده و سپس به مدت 30 دقيقه در يخ قراردادهشد.
3- شوک حرارتي C° 42 به مدت 90 ثانيه به مخلوط فوق داده شد و بلافاصله نمونه به مدت 3 تا 5 دقيقه بر روي يخ قرار دادهشد.
4- 50 ميکروليتر محيط LB مايع بدون آنتيبيوتيک به مخلوط فوق اضافهشده و به مدت 45 تا 60 دقيقه بسته به نوع آنتيبيوتيک در شيکر انکوباتور در 37 قرارداده شد. اين زمان به باکتريها فرصت بازيابي و بيان ژن مقاومت به آنتيبيوتيک پلاسميدي را ميدهد.
5- بعد از اين زمان که سلولها، DNA خارجي را دريافت کردهاند ميتوان بخشي از آنها را بطور مستقيم کشت داد و بخش ديگر را براي بررسيها در C? 4 نگهداريکرد.

به منظور کنترل انتقال DNA به داخل سلول، دو واکنش انتقال زير، بطور همزمان با مراحل فوق انجام شد:
1- انجام مراحل انتقال بدون افزودن پلاسميد بهعنوان کنترل منفي
2- انجام مراحل انتقال با DNA حامل بريده نشده بهعنوان کنترل مثبت

8-5-2 واکنش زنجيرهاي پليمراز(Polymerase chain reaction, PCR)
موادي که در يک واکنش PCR استفاده مي شود بطور خلاصه شامل: DNA الگو، دي اکسي نوکلئوتيد تري فسفات (dNTP)، آنزيم Taq DNA پلي مراز و يا pfu DNA پلي مراز(و يا ساير آنزيم هاي پلي مرازي بسته به ماهيت کار) و بافر مخصوص آن آنزيم، کلريد منيزيم (MgCl2) براي آنزيم Taq DNA پلي مراز و سولفات منيزيم (MgSo4) براي آنزيم Pfu مي باشد.
سه مرحله اصلي PCR عبارتند از: دناتوره شدن، جفت شدن آغازگر و پلي مريزه شدن که در اين تحقيق دماي جفت شدن تمامي آغازگرهاي استفاده شده?C 56 بودند.
1-8-5-2 SOEing-PCR (Splicing by overlap extension PCR)
SOE- PCR جهت ايجاد جهشهاي حذف و يا اضافه و جهشهاي نقطهاي در يک توالي DNA قابل استفاده است. مبناي اين روش طراحي و استفاده از پرايمرهاي کايمريک و پرايمرهاي دو انتهاي ژن مي باشد بنحوي که پرايمر هاي کايمريک محل ايجاد جهش را دربرمي گيرد و قطعات بدست آمده يک قسمت مشابه در انتهاي 5´ دارند.سپس دو قطعه تکثير شده تخليص ميشود تا پرايمرهاي اوليه حذف شوند و دوباره در يک واکنش PCR دوم مخلوط مي شوند که فقط حاوي دو پرايمر نواحي انتهايي مي باشد. در اين تحقيق با استفاده از آغازگر هاي (CS3FF ,-F2 ,-R ,-F1 و CS3RR) و (CS3FF ,-F2 ,-R ,-BF1 و CS3RR) به ترتيب. قطعات نوکلئوتيدي 81 و 123 جفت بازي که کد کننده موتيف و بتاموتيف جاذب کادميوم ميباشند پس از طراحي در غالب پرايمر طي واکنش SOEingPCR (Splicing by overlap extension PCR) مطابق شکل 2-3 در طي دو مرحله PCR در مناطق مجاز(به عنوان مثال در محل اسيدآمينه 38 پروتئينCStH بالغ) زيرواحد اصلي پيلي CS3 (CStH) وارد شدند (Karkhane et al., 2009).
PCR اول
تکثيرهاي اوليه PCR کاملا شبيه به دستورالعمل استاندار PCR انجام شد. در واکنش PCR اول ابتدا با استفاده از آغازگرهاي(38-R وCS3-FF) و (38-F1 و CS3RR و يا 38-BF1 و CS3RR) دو واکنش PCR انجام شده سپس محصول PCR از روي ژل بازيافت شد و به عنوان الگو براي PCR ديگري با پرايمرهاي (38-F2 و CS3RR) مورد استفادهقرارگرفت
PCR دوم
PCR دوم شامل يک مرحله SOEing و يک واکنش PCR با دستوراالعمل معمولميباشد. براي انجام SOEing دو محصول تکثير شده در واکنشهاي PCR اول (PCR1 وPCR3) پس از بازيافت از روي ژل به نسبت 1:1 از لحاظ مولي باهم مخلوط شدند و چون داراي نواحي مشترک مي باشند (دو پرايمر -F2 و -R که در دو واکنش PCR مورد استفاده قرار گرفتند داراي نواحي مشترک مي باشند) از طريق ناحيه مشترک به يکديگر متصلشده و و طي هفت سيکل و بدون افزودن آغازگر تکثير شدند. سپس آغازگرهاي دو انتهاي ژن (CS3-FF و CS3-RR) به واکنش در حال انجام اضافهشد و ادامه واکنش مطابق روشهاي معمول PCR طي 30 سيکل تکميل گرديد(جدول2-10) .
جدول2-10. ترکيبات استفاده شده در يک واکنش SOEing-PCR
مقادير(ميکروليتر)
مواد
5/1
10X PCR Buffer
1
10mM dNTP
5/1
50mM MgSo4
1 (از هرکدام)
(10pmol) primer
5/0
pfuDNA Polymerase
5
(50 ng) DNA
تا 50 ميکروليتر
ddH2O

شکل 2-3. SOEing-PCR براي وارد کردن موتيف متصلشونده به فلز سنگين در جايگاه مجاز 38 و ساخت وکتور بياني. (A) پلاسميد pPM4555 حامل ژن cstH. (B) تصوير کلي از ترتيب و آرايش تواليهاي وارد شونده که به عنوان آغازگر طراحي و استفاده شدند. (C) مراحل SOEing-PCR براي واردکردن موتيف در ژن cstH. (D) ساخت پلاسميد نوترکيب pEYS38cbm1 (در شکل به نام pEYS38m1 معرفي شده است)حامل ژن هيبريد cstH::cbm . ( (Eساخت پلاسميد بياني حامل اپرون cst نوترکيب حاوي DNAکدکننده موتيف متصل شونده به فلز سنگين
9-5-2 کلونينگ ژن جهش يافته cstHدر وکتورpBR322
ساخت DNA نوترکيب در مهندسي ژنتيک از اتصال DNA به يک حامل صورت مي گيرد. معمولا قطعه خارجي که وارد پلاسميد ميشود يا محصول PCR است که در اين صورت اگر واکنش PCRبا آنزيم pfu انجام گرفتهباشد انتهاهاي محصول PCR صاف بوده و در وکتوري که با آنزيمهاي برشدهنده ايجاد کننده انتهاهاي صاف بريده شده، کلون ميگردد. يا اينکه DNA خارجي محصول واکنش برش آنزيمي ميباشد که در اينصورت معمولا پلاسميد حامل با آنزيمي بريده ميشود که DNA خارجي با آن بريده شده و بدين ترتيب دو ملکول (وکتور و DNA خارجي) داراي انتهاهاي قابل جفتشدن هستند، توليد شدند
به منظور همسانه ژن cstH جهشيافته، مراحل زير بر طبق روشهاي استاندارد مولکولي انجام شد(Russell, 2001) :
1) ابتدا ناقل pBR322 از درون باکتري DH5? E. coli بوسيله کيت استخراج DNAاستخراج گرديد. برش آنزيمي بر روي ناقل pBR322 طبق جدول 2-11 در دماي 37 درجه سانتيگراد به مدت 4 ساعت صورت گرفت. پس از انجام الکتروفورز بر روي ژل آگارز 1درصد و اطمينان از بريده شدن کامل ناقل، قطعه مورد نظر به کمک کيت استخراج از روي ژل، تخليص شد.
جدول2-11. واكنش برشآنزيمي پلاسميد pPR322

ترکيبات
حجم(ميکروليتر)
آب مقطر
14
pBR322
20
بافر(10X) B فرمنتاز
4
EcoRV
2

2) پس از الکتروفورز محصول نهايي PCR بر روي ژل آگارز 1درصد و اطمينان از صحت اندازه آن، قطعه مورد نظر به کمک کيت استخراج از روي ژلآگارز تخليص شد.

3) کيفيت و کميت پلاسميد و ژن جهش يافته cstH خالص شده از ژل، به وسيله الکتروفورز بر روي ژل آگارز يک درصد و سپس روش اسپکتروفتومتري (260 نانومتر و 280 نانومتر) بررسي شد.

4) الحاق محصول PCR با ناقل برشخورده pBR322 توسط آنزيم ليگاز T4 و در واکنش آنزيمي (جدول2-12) به مدت يک شب در 22 درجه سانتيگراد صورت گرفت.

جدول 2-12. تركيبات مورد استفاده براي واكنش الحاق

ترکيبات
حجم(ميکروليتر)
آب مقطر
4
بافر ليگاز T4 (X10)
3
ژن موتانت cstH
15
ناقل برش خورده pBR322
6
ليگاز T4 (5 U/µl)
2

5) محصول الحاق (پلاسميد نوتركيب pEYS38m1) با روش شوكحرارتي به سلولهاي مستعد E. coli DH5? منتقل و سلولهاي تراريخت روي محيطکشت جامد حاوي آمپيسيلين (غلظت µg/ml 100) كشت و در انکوباتور 37 درجه سانتيگراد به مدت 18 ساعت نگهداري شد.

10-5-2 تائيد صحت کلونهاي واجد پلاسميد نوترکيب (Screening)
پس از انتقال DNA نوترکيب به درون سلول ميزبان لازم است که کلونهاي حاوي پلاسميد نوترکيب مناسب غربال و انتخاب شوند. به اين منظور از چند روش زير استفاده شد.
الف) غير فعال شدن ژن حساسيت و مقاومت کلون ها به آنتيبيوتيک: پلاسميدهاي ايجاد شده در اين تحقيق حامل ژن مقاومت به آنتيبيوتيک آمپيسيلين ميباشند به اين طريق، کلونهايي که پلاسميد را در طي ترانسفورماسيون دريافت کردهبودند در محيطکشت داراي آنتيبيوتيک آمپيسيلين رشد کرده و از ساير کلونها جداشدند و در ادامه با استفاده از روشهاي دقيقتر کلونهاي مورد نظر از ساير کلونها تفکيک شدند.
ب) واکنش PCR: با استفاده از روش PCR وجود قطعه خارجي در حامل و نيز نحوه قرار گرفتن آن در DNA حامل مورد بررسي قرار گرفت. در اين روش حداقل يکي از پرايمرها مکمل قطعهخارجي بوده و ديگري يا مکمل انتهاي ديگر DNA خارجي و يا مکمل DNA حامل بود. همچنين بررسي وجود DNA خارجي با استفاده از يک جفت آغازگر که مکمل حامل در قبل و بعد از محل قرار گرفتن DNA خارجي بود نيز انجامشد، در نتيجه پلاسميدهاي نوترکيب از ساير پلاسميدها جدا و انتخاب شدند.
ج) برشآنزيمي DNA با استفاده از آنزيم هاي برش دهنده اختصاصي: DNA پلاسميدهاي نوترکيب که با روش PCR انتخاب شده بودند با يک يا دو آنزيم برش دهنده ويژه برش دادهشدند و همزمان با آن DNA پلاسميدي حامل، بهعنوان شاهد با همان آنزيمها برش داده شد. نمونههاي برش يافته توسط الکتروفورز روي ژل آگارز بررسي شدند. با مقايسه اندازه قطعات حاصل از برش پلاسميدهاي حامل و نوترکيب، کلونهاي واجد قطعه DNA خارجي که سنگينتر هستند از ساير پلاسميدها جدا شدند.
د) تعيين توالي به عنوان تائيد نهايي: انتخاب نهايي کلونهاي نوترکيب پس از تعيين توالي آنها و مقايسه توالي ژن cstH نوترکيب با توالي ژن cstH طبيعي و توالي DNA اتصالي به آن انجام گرفت.

11-5-2 بررسي پروتيئنها
1-11-5-2 استخراج پروتيئن پيلي از باکتري
باکتري بيان کننده پيلي ابتدا از ذخيره 70 – بصورت کشت مايع در ويال 2ميليليتر در حجم 300 تا 500 ماکروليتر به مدت 16 ساعت کشت شدند
2- سپس 100 ميکروليتر از کشت مايع به محيط کشتAgar CFA منتقل شد و بمدت 20 ساعت در دماي C° 37 انکوبه گرديد
3- باکتريهاي رشد يافته با کمک لوپ شيشهاي از روي پليت جمع آوريشد و به ويالهاي حاوي 1 ميليليتر PBS منتقل شد وپس از مخلوطکردن، سوسپانسيون سلولي به مدت 20 تا 30 دقيقه در دماي C° 60 قرار داده شد.
4- سوسپانسيون سلولي حرارت ديده بمدت يک دقيقه ورتکسگرديد.
5- با سانتريفوژ در دورrpm 11000 بهمدت 15 دقيقه و در دماي اتاق سلولهاي باکتري رسوب دادهشدند.
6- محلول رويي که حاوي پيلي است برداشتهشد و به آن TCA با غلظت نهايي 12 درصد اضافهگرديد و به آرامي تکان دادهشد تا مخلوطگردد سپس به مدت يکساعت بر روي يخ قرار دادهشد.
7- مخلوط فوق بمدت 15 دقيقه با دور rpm 13000 سانتريفوژ گرديد تا پروتئين پيلي رسوب کند.
8- رسوب پروتئين پيلي درتريس بازي mM 100 حل گرديد و تا زمان مصرف در دماي ?C20- نگهداريشد.
2-11-5-2 سنجش پروتيئن به روش برادفورد(Baradford)
روش برادفورد نسبت به روشهاي لوري و بيوره سادهتر و سريعتر ميباشد. در اين روش رنگ کوماسيبريليانتبلو G-250مستقيما با پروتئين ترکيب شده و ميتوان جذبنوري آن را در 595 نانومتر اندازه گيري نمود(Bradford, 1976).
1-2-11-5-2 رسم منحني استاندارد پروتئين
محلول استاندار پروتيئن (BSA,Bovin Serum Albumin) با رقتهاي 1/. تا 9/. ميلي گرم در ميليليتر و يک لوله به عنوان شاهد حاوي يک ميليليتر آب مقطر تهيهشد. نمونه مورد آزمايش نيز در چند رقت تهيه گرديد، سپس به هر لوله 5 ميليليتر از معرف آماده شده اضافهگرديد. پس از ورتکس کردن، نمونهها در طول موج 595 نانومتر در مقابل شاهد خواندهشد. پس از رسم منحني استاندارد پروتئين غلظت نمونه از روي منحني محاسبهگرديد.
3-11-5-2 وسترنبلاتينگ (Western Blotting)
براي بررسي وجود يک پروتئين خاص در يک نمونه، از واکنش اختصاصي آنتيژن با آنتيبادي استفاده ميشود. اگر اين آنتيبادي به آنزيمي متصل باشد که بتواند يک سوبسترا را به محصول رنگي تبديل نمايد، آنتيژن

پایان نامه
Previous Entries تحقیق رایگان درباره هيبريد، پلاسميد، پروتئين Next Entries پایان نامه با واژه های کلیدی هدف گذاری، چند متغیره، مصرف انرژی