تحقیق رایگان درباره پروتئين، پپتيدهاي، ساير

دانلود پایان نامه ارشد

هيدروفيل و ضرورتا فاقد تواليهاي سيستئين باشند. زيرا پروتيئن هاي داراي پلهاي گوگردي(S-S) در عبور از ديواره سلولي دچار اختلال ميشوند. (2) گزارشات نشان ميدهد پروتئينهاي ساختاري اکثر پيليها، تواليهاي با اندازه نسبتا متوسط (اسيدآمينه 10±30) را بدون عکسالعمل خاصي پذيرفته و در سطح سلول ارائه مينمايند ولي پپتيدهاي خارجي بزرگ عملکرد آنها را تحت تاثير و تخريب قرار ميدهند.
پيلي CS3 که بوسيله بسياري از سويههاي اشريشياکلي مولد انتروتوكسين بيان مي‌شود، به عنوان يک سيستم مناسب عرضه سطحي باکتريايي براي نمايش پپتيدهاي هترولوگ مانند اپي‌توپ‌هاي متصل شونده به فلزات استفاده شده‌است. ساختار اين پيلي مانند ساير پيليها شامل هزاران زير واحد اصلي و يکسان است که CstH ناميدهمي‌شود(Yakhchali and Manning, 1997) و استراتژي بکارگيري آن مشابه ساير پروتئين‌هايي که بدين منظور استفاده مي‌شود، شامل وارد کردن توالي هترولوگ درون محل‌هاي مجاز و بدين طريق ارائه آن در سطح مي‌باشد (Hedegaard et al., 1989, Saffar, 2005). در اين مطالعه از پيلي CS3 به عنوان سيستم نمايش دهنده سطحي استفاده شد. اين پيلي بخوبي مطالعه شدهاست و ژنهاي سازنده آن شناسايي، کلون و تعيين توالي شدهاست (Manning et al.,1985, Jalajakumari et al., 1989). اين پيلي بسيار نازک (~2nm) و قابل انعطافتر نسبت به ساير پيليها ميباشد(Levine et al., 1984) بنابراين نواحي در معرض آن نسبت به پيليهاي ضخيم، بيشتر است.
زيرواحد اصلي پيلي CS3 که پروتئين CstH ميباشد تعداد زيادي اسيدآمينه پرولين و گلايسين دارد که اين امر باعث ايجاد خمش و در نتيجه ايجاد نواحي در معرض (نواحي کويل) در آن ميگردد. علاوه بر اين در توالي CstH هيچ اسيدآمينه سيستئيني وجود ندارد که اين خود يک امتياز محسوب ميشود.
يکي از پيشرفتهاي چشمگير در سالهاي اخير، بهره‌گيري از ابزارهاي بيوانفورماتيکي جهت کسب اطلاعات با ارزش ساختاري و عملکردي پروتئين‌ها و کاربرد آنها در مهندسي پروتئين‌ها از جمله ارائه سطحي هترولوگها مي‌باشد،‌‌اطلاعاتي که گاه براي يافتن آنها با استفاده از روش‌هاي آزمايشگاهي ماهها و سالها وقت صرف مي‌شد.
جهت عرضه و نمايش پپتيدهاي خارجي بايد آنها را در مکان‌هايي از پروتئين به نام مناطق‌مجاز وارد کرد. تصور مي‌شود نواحي در معرض محيط و قابل دسترس و آبدوست که ساختار کويل(coil) نيز دارند کانديداي مناسبي‌، براي مناطق مجاز و وارد کردن پپتيدهاي بيگانه جهت عرضه سطحي هستند(Macdonald and Johnson, 2001, Sujatha and Balaji, 2006, Hedegaard et al., 1989).
در دهه‌هاي گذشته پيشگويي مناطق مجاز، با روشهاي آزمايشگاهي و با صرف هزينه و زمان زياد مانند وارد کردن پپتيدها يا اپي‌توپهاي کوچک گزارشگر و بيان آنها انجام مي‌پذيرفت واغلب اوقات نيز بکار بردن چنين مناطقي براي پپتيدهاي خارجي بدليل مطابقت نداشتن با اپي‌توپ‌هاي گزارشگر با شکست مواجه مي‌شد (chlehuber.2004, Armstrong.1995) ولي اکنون با بکار‌گيري و انتخاب الگوريتم‌هاي دقيق و ياري جستن از نرم افزارهاي کامپيوتري و روشهاي بيوانفورماتيکي جهت پيشگويي مناطق آب دوست (مناطق هيدروفيل)، ساختار دوم و ساختار سه بعدي پروتئين و …. ، پيشگويي مناطق مجاز پروتئين با اطمينان بيشتري انجام مي‌شود و بدين ترتيب انجام پروژه‌‌ هاي پيچيده مهندسي پروتئين، بر مبناي پيشگويي ساختاري، آناليز استرئوشيميايي و انرژتيک آنها با استفاده از روش‌هاي بيوانفورماتيک و در مدت زمان بسيار کوتاه نسبت به دهه‌هاي گذشته دور از ذهن نيست (Cheng et al., 2007, Vivona et al., 2008).
در اين مطالعه به کمک نرمافزارها، سرورها و روشهاي پيشگويي ساختار دوم پروتئين، روشهاي ارزيابي وضعيت پروتئين از لحاظ احتمال بيان بصورت اينکلوژنبادي، تعيين منحني‌هاي مسير آبدوست و آبگريز پروتئين، آناليز تطابق و همرديفي توالي مورد بررسي با توالي‌هاي موجود در بانکهاي اطلاعات زيستي، ارائه مدلهاي ساختار سوم از طريق روشهاي مقايسه تواليها و بندکشي و آناليز مدلهاي حاصل از لحاظ مناطق قابل دسترس و مناطق درگير در اتصالات پروتئيني، موقعيتهاي38-39 ، 66 -67 ،79-80 ،92-93 و 108-107 در پروتئين CStH بالغ به عنوان مناطق مجاز زيرواحد CStH پيلي CS3 براي وارد کردن پپتيدهاي خارجي پيش‌بيني و مورد تجربه قرارگرفت. مقايسه نتايج اين تحقيق با تجارب آزمايشگاهي قبلي براي نمايش سطحي هگزاهيستيدين، پپتيد غني از سيستئين (قابليت اتصال به فلزات را دارد) (Saffar, 2005)، سم مقاوم به حرارت اشريشياکلي مولد انتروتوکسين (Heat Stable Enterotoxin) و شاخص آنتي‌ژنيک انتروتوکسين NSP4 روتاويروس(Hosseini et al., 2002) نشان‌داد که نقاط مجاز پيش‌بيني شده نه تنها با نتايج آزمايشگاهي قبلي مطابقت دارد (منطقه 66 در مطالعات پيشين به عنوان محل مجاز براي ورود پپتيدهاي بيگانه استفاده شدهبود و در اين تحقيق نيز به عنوان يکي از مناطق مجاز پيشگويي گرديد) بلکه پيش بيني نقاط جديد با امتياز پيشگويي و همچنين بيان و خاصيت جذب بالا نسبت به ناحيه 66 (به شکلهاي 27-3 و 3-28 بخش نتايج مراجعه شود) بيانگر قابل اتکا بودن نتايج مطالعات نرم‌افزاري (حداقل در اين نوع پروتئين ها و کاربرد مورد نظر) بوده و حتي به عنوان يک ضرورت در اين قبيل از تجربيات محسوب ميشود. از نتايج اين تحقيق ميتوان چنين برداشت نمود که يکي از راهکارها جهت بهينهسازي سيستمهاي جاذب فلزات سنگين، انتخاب جايگاه مجاز مناسب براي ورود پپتيدهاي جاذب فلزات سنگين ميباشد. در اين تحقيق جايگاههاي مجاز 38 و 107 نسبت به ساير جايگاهها کارايي بالاي در جذب را نشان ميدهد. يکي از دلايل احتمالي جذب بالا نزديکي و همسايگي اين مناطق نسبت به دو منطقه اتصالي عمده ملکولهاي زيرواحدهاي پيلي يعني نواحي انتهاي آميني و انتهاي کربوکسيلي ميباشد. بنظر ميرسد تاثير متقابل پپتيدهاي ورودي و پروتئين حامل نسبت به ساير جايگاهها کمتر ميباشد بعبارت ديگر هر دو ملکول از لحاظ ساختار و فعاليت کمتر دچار اختلال ميشوند. نکته قابل توجه ديگر در رابطه با خصوصيات جايگاه ورود، ظهور انتخاب و Selectivity بالاي جايگاه 38 نسبت به ساير مکانهاي پذيرش پپتيد بيگانه ميباشد. پاسخ احتمالي براي اين موضوع در زمينه و ترکيب اسيدآمينهاي محل مجاز نهفتهاست. همچنانکه که در بخش مقدمه گفتهشد در اغلب پروتئينهاي ناقل کادميوم، در موقعيت 44 نسبت به توالي توافقي (C-X-X-C) موتيف اتصالي به فلز سنگين، اسيدآمينه آسپارتيک و در برخي موارد گلوتاميک قرار گرفتهاست. بررسي ترکيب اسيد آمينهاي پروتئين CstH نيز نشانداد با ورود موتيف 27 اسيدآمينهاي جاذب کادميوم، شرايط زمينهاي فوق براي توالي توافقي فراهم ميشود و اسيدآمينه آسپارتيک (اسيدآمينه شماره 64 پروتئين CstH) در فاصله 44 اسيدآمينهاي نسبت به اسيدآمينه سيستئين توالي توافقي (C-X-X-C) قرار ميگيرد و بدين ترتيب آرايش فضايي مناسبي براي پيوند و اتصال به کادميوم در مقايسه با ساير فلزات فراهم ميشود (شکل4-1).
در اينجا لازم است اين نکته اضافه شود که: اگرچه علم زيستفناوري براي ارائه پروتئينهاي هترولوگ بعنوان بيوکاتاليستها و بيوجاذبها يک تکنولوژي جديد و بسيار توسعه يافتهتر از متدهاي مرسوم ميباشد با اين حال بسياري از مطالعات تا کنون فقط در سطح آزمايشگاه انجام گرفتهاست واکثر آنها فاقد اطلاعات مربوط به عمل بيوجاذبها تحت نفوذ شرايط مختلف محيط واقعي هستند و تنظيمات بسيار اساسي جهت توسعه موفقيت آميز جاذبهاي زيستي لازم است و حتي تحت شرايط آزمايشگاهي، درجه سودمندي سيستمهاي توسعه يافته، تحت پارامترهاي وسيع و متنوع محيطي (شرايط زنده و غيرزنده) ارزيابي نشدهاست.

(A) (B)
شکل 4- 1. ساختار دمين متصل شونده به فلز واقع در انتهاي آميني پروتئين CadA باکتري ليستريا مونوسيتوژن و مدل پيشنهادي براي نحوه پيوند فلز با موتيف. (A) موتيف اتصالي به کادميوم از اين دمين استخراج شدهاست. اتصالات واندروالس که دربردارنده اسيدهايآمينه هيدروفوب ميباشند به رنگ آبي مشخص شدهاند، ليگاندهاي پروتئيني به رنگ زرد نشان دادهشده و برخي از اسيدهايآمينه بسيار حفاظت شده به رنگ قرمز نمايش دادهشدهاند. به موقعيت فضايي سيستئين 14 و 17 و همچنين گلوتامين 61 توجه نمائيد. (B) مدل پيشنهادي براي اتصال فلز به موتيف متصل شونده به فلز کادميوم، خطوط شکسته نشانگر فواصل زياد بين Cd-S ميباشد (Banci et al., 2006)

3-4 مقايسه موتيفهاي طراحيشده جهت جذب يون کادميوم توسط باکتريهاي نوترکيب ساختهشده در اين پروژه با مطالعات پيشين
تخليه فلزات سنگين ناشي از فعاليت هاي کشاورزي، صنعتي و دفاعي، محيطزيست را با خطرات جدي مواجه نمودهاست. روشهاي مرسوم جهت زدودن آلايندهها از آب در حد استاندارها کافي نبوده، لذا تحقيقات بيشتري را در اين حوزه مي طلبد که پروژه اخير يک نمونه از تحقيقاتي است که بر روي توسعه جاذبهاي زيستي با تمايل، ظرفيت و اختصاصيت بالا جهت جذب کادميوم متمرکز شدهاست.
موجودات يوکاريوتي ميزان فلزات آزاد فعال را از طريق محبوس کننده هاي داخل سلولي کنترل مي کنند. گلوتاتي(GSH)، فيتوکلاتين وابسته به گلوتاتيون (PCs) و متالوتيونينهاي غني از سيستئين (Winklemann and Winge, 1994) از عمده پپتيدهاي محدود کننده فلزات هستند که بوسيله سلولها بکار گرفته ميشوند. تلاشهاي پيشين براي توليد اين پپتيدها در باکتري E. coliبراي افزايش توانايي خاصيت اتصال فلزي آنها در برخي موارد موفقيت آميز بودهاست. به عنوان مثال نشان داده شدهاست که باکتريهاي E .coli بيان کننده MTهاي نوروسپورا کراسا ميتوانند بطور کارآمدي مس، کادميوم و ساير فلزات را جذب کنند. با اين حال بيان اين پروتئينهاي غني از سيستئين بدليل تداخل با مسير اکسيداسيون و احيا در سيتوزول چندان هم بياشکال و موفقيتآميز نيستند (Pazirandeh et al., 1998, Bardwell, 1994) و مهمتر اينکه، بيان داخل سلولي MTها مانع از استفاده مجدد جاذب زيستي به سبب گير افتادن آنها ميشوند .(Gadd and White, 1993)يک رويکرد هوشمندانه براي گذر از اين موانع، بيان سطحي متالوتيونينها بودهاست. با اين حال استفاده از پپتيدها و پروتئينهاي برزگي که در طبيعت براي جذب فلزات بکار ميرود چندان هم موفقيت آميز نبودهاست زيرا علاوه بر مشکلات بيان اين پروتئينها در پروتئينهاي سطحي(به دليل اندازه بزرگ آنها)، بيان آنها از لحاظ سوخت و سازي نيز هزينه زيادي را دربردارد. لذا طراحي از ابتدا104 پپتيدهاي مختلف متصلشونده به فلز راه حل ديگري ميباشد که توسط گروهي از محقيقين جهت افزايش تمايل و اختصاصيت جذب فلزات بکار رفتهاست(Sousa et al., 1996) and Samuelson et al., 2000, Kotrba et al., 1999b). براي مثال نشان داده شدهاست پپتيدهاي با تواليهاي غني از سيستئين و هيستيدين که با تمايل و افنيتي بالايي به Cd2+ و Hg2+ متصل ميشوند. در سال 1996، Sousa وهمکارانش با قرار دادن يک يا دو دسته هگزا هستيدين در پروتئين LamB نشان دادند. سويههايي که هيستيدين را در سطح خود ارائه مينمايند به ميزان 11 بار بيشتر از سويههاي بدون آن کادميوم را جذب مينمايند. در مطالعه ديگري Mejare و همکارانش در سال 1998، پپتيد His-Ser-Gln-Lys-Val-Phe را در پروتئين OmpA کلون و در سطح باکتري E. coli بيان کردند. نتايج نشانداد سلولهايي که اين پپتيد را بيان ميکنند در محيط سمي داراي CdCl2 ميتوانند رشدکنند، که اين امر حاکي از آنست که اتصال کادميوم به پپتيد ارائه شده در سطح مانع از سميت آن ميگردد(Mejare et al., 1998). همچنين نشان دادهشد که سلولهاي بيانکننده ساير تواليهاي غني از هيستدين (Gly-His-His-Pro-His-Gly) و سيستئين (Gly-Cys-Gly-Cys-Pro-Cys)- با تمايل بيشتري نسبت به ساير عناصر دو ظرفيتي به جيوه متصل ميشوند. همچنين آنها نشان دادند با ورود اين توالي غني از سيستئين (MBSs) در ژنLamB ميزان جذب يون کادميوم از nmol/mg125 وزن خشک باکتري در نمونه هاي کنترل به nmol/mg227 وزن

پایان نامه
Previous Entries پایان نامه با واژه های کلیدی هزینه سرمایه، برنامه ریزی خطی، دوره بازگشت Next Entries پایان نامه با واژه های کلیدی هدف گذاری