تحقیق رایگان درباره پروتئين، باکتري، موتيف

دانلود پایان نامه ارشد

قابل رديابي و آشکارسازي است. اساس وسترنبلات نيز همين واکنش است. ابتدا نمونههاي مورد نظر با استفاده از ژل SDS-PAGE الکتروفورز شد. ژل به مدت حداقل 10 دقيقه در بافر انتقال قرارداده شد.
سپس غشاء PVDF (polyvinylidene difluoride microporous membrane filters) و نيتروسلولز را به اندازه ژل بريده و به ترتيب در متانل به مدت يک دقيقه، آب مقطر 5-7 دقيقه و بافر انتقال تازه تهيه شده به مدت 10 دقيقه قرار دادهشد، چند لايه کاغذ صافي با ابعاد مناسب با ژل بريده و در بافر خيس گرديد سپس اجزاي فوق از پايين به بالا شامل اسفنج، چند لايه کاغذ صافي، ژل، غشاء، چند لايه کاغذ صافي و لايه اسفنج روي هم قرار داده شد. پس از گذاشتن هر لايه حبابهاي هوا به کمک غلتک مخصوص ازحد فاصل لايهها خارج گرديد و درون تانک مخصوص به گونهاي قرار دادهشد که ژل به طرف قطب منفي و غشا PVDFيا کاغذ نيتروسلولز به طرف قطب مثبت باشد. سپس مجموعه را به اتاق سرد منتقل کرده و شدت جريان 40 ميليولت در بصورت شبانه برقرارگرديد تا پروتئينها از روي ژل به غشاء انتقال يابند مراحل وسترنبلاتينگ به ترتيب زير انجامشد.
1- با استفاده از بافر Blocking، مناطق فاقد پروتئين غشا به مدت 1 ساعت در دماي اتاق بلوکهگرديد.
2- با استفاده از بافر شستشو غشا براي سه تا چهار بار شستهشد.
3- آنتيبادي اوليه عليه CS3 با تراکم مناسب (1:1000) به غشاء اضافهگرديد و به مدت 2 ساعت در مجاورت آنتيبادي در دماي اتاق قرارگرفت.
4- شستشو مانند مرحله 2 انجامگرفت.
5- آنتيباديثانويه (Goat anti Rabbit-HRP) با نسبت مناسب (1:3000) به مدت حداقل يک ساعت به غشا اضافهشد.
6- شسشو مانند مرحله 2 انجام گرفت
7- 10 ميليليتر محلول شستشو، 2 ميلي ليتر محلول سوبسترا و 15-30 ميکروليتر آب اکسيژنه 30 درصد با هم مخلوط گرديده و بر روي غشاء اضافه شد. پس از انجام واکنش و ظهور باندها، غشاء شستشو دادهشد(Dunbar, 1994).

4-11-5-2 لکهگذاري براي سلولهاي باکتري
براي بررسي سريع حضور يک پروتئين خاص در نمونه از عمل لکه گذاري (Dot Blotting) استفاده شد. اين عمل همانند وسترنبلات ميباشد با اين تفاوت که:
نمونه هاي باکتري يا پروتئيني به جاي اينکه ابتدا بر روي ژل SDS-PAGE الکتروفورز شوند، مستقيما بر روي کاغذ نيتروسلولز به صورت لکه گذاشتهشدند. مقدار 2-5 ميکروليتر از سوسپانسيون باکتري با تراکم 6/. الي 6/ 1 =A600 nm يا 5-10 ميکروليتر از پروتئين پيلي روي کاغذ نيتروسلولز قرار داده شد و تمام مراحل مربوط به وسترنبلاتينگ (مراحل 1 تا 7 قسمت قبل) عينا انجام شد و در نهايت بعد از آشکارسازي (مرحله 7) پروتئين بصورت لکههايي بر روي کاغذ ظاهرشد(Rodas et al., 2011).
12-5-2 رنگ آميزي ايمينوفلوروسنس
براي نمايش پپتيد يا پروتئين خاص روي سطح باکتري مي توان از رنگ آميزي ايمينوفلوروسنس استفاده کرد. روش کار بدين شرح است.
1- از کشتشبانه باکتري در محيط مايع، 100 ميکروليتر روي محيط CFA آگار کشت شد سپس بعد از 18- 20 ساعت کشت شبانه، سوسپانسيون سلولي تهيه شده و حدود 3-5 ميکروليتر از آن روي لام ميکروسکوپ گسترش تهيهشد
2- با قرار دادن لام در محيطخشک بصورت شبانه در دماي اتاق باکتريها روي لام تثبيت شدند.
3- با مقدار 50-100 ميکروليتر از آنتيبادي اوليه (رقت 1:1000 در بافر PBS) سطح نمونه پوشانده شد. آنتيبادي اوليه در اين تحقيق پليکلونال آنتيبادي بر عليه CS3 بود.
4- لام به مدت يک ساعت در دماي اتاق انکوبهشد.
5-سپس چند بار با بافر PBS شستشو دادهشد.
6- سطح نمونه با آنتيباديثانويه که کانجوگه با فلوروسين است. با رقت 1:20 در بافر PBS پوشانده شد.
7- سپس لام به مدت يک ساعت در دماي اتاق انکوبه شد.
8- شستشو مانند مرحله 5 انجام گرفت.
9- سلولهاي رنگ شده زير ميکروسکوپ فلوروسنت قابل مشاهدهبودند(Peiser et al., 2000).

13-5-2 بررسي ميزان جذب يون فلز
بررسي توانايي سلولهاي باکتري در اتصال به يونهاي فلزات سنگين توسط دستگاه جذب اتمي (Shimadzu) AA670/G انجامشد. مراحل کار بدين شرح است
1- باکتري مورد نظر روي پليت CFAآگار کشت دادهشد.
2- باکتريهاي رشد يافته از روي سطح پليت جمع آوريشدند.
3- سلولها در دو مرحله با بافر pH:7.4 1mM Tris-Hcl شستشو دادهشدند.
4- سپس سلولها در 10 ميليليتر بافر فوق سوسپانسيون شده و OD600 آنها اندازه گيري شد.
5- بر اساس ارتباط بينOD600 و وزن تر سلول( بر اساس گزارشات موجود OD600 برابر 1 معادل 200 ميليگرم وزن تر باکتري مي باشد)، 200 ميلي گرم باکتري در 40 ميليليتر بافر داراي مقدار معين از فلز سنگين سوسپانسيون شد.
6- سوسپانسيو سلولي در بافر داراي فلز سنگين در شيکرانکوباتور با دور rpm100در دماي °C30 به مدت 10-15 دقيقه انکوبهگرديد.
7- سپس سلولها با سانتريفوژ دور پايين رسوب داده شدند.
8- رسوب سلولي به صورت شبانه در آون با دماي°C 105 خشک شد.
9- وزن خشک سلول اندازه گيري شد سپس به ازاي هر 4 ميلي گرم باکتري خشک، 500 ميکروليتر اسيدنيتريک 65% به رسوبات اضافهشد و يک ساعت در بن ماري دماي جوش انکوبهگرديد.
10- غلظت هريک از فلزات کادميوم، مس، نيکل و کروم به ترتيب در طول موجهاي8/228،8/324،232 و 9/357 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتري مدل (Shimadzu) AA670/G اندازه گيريشد.

14-5-2 ويژگيهاي پلاسميدهاي استفادهشده در اين مطالعه
اپرون کامل پيلي CS3 به نام (cst) از E.coli مولد انترتوکسين از سويه PE486 در جايگاه برش آنزيمي HindIII پلاسميد pBC قرار دادهشده و بدين ترتيب پلاسميد pPM4567 با اندازه حدود 8Kbp حاصل شد( شکل2-4)،که بعلت بزرگي اندازه آن کار با آن سخت بوده لذا زيرواحد اصلي پيلي (CstH) بطول حدود bp655 که سازنده واحدهاي پليمر پيلي بوده و بهعنوان ژن يا پروتئين ناقل تحت دست ورزي قرار ميگيرد بطور جداگانه در پلاسميد pBSK کلون و پلاسميد pPM4555 ايجاد گرديد(Yakhchali 1996) (شکل2-4).

شکل2-4. نقشه ژنتيکي پلاسميدهاي دارنده ژن کامل اپرون cst (pPM4567) و ژنcstH (pPM4555).

15-5-2 بررسي هاي آماري
در تمامي آزمايشات که نياز به بررسيهاي آماري داشت از نرمافزار SPSS و از آزمونهاي موردنظر استفادهشد. جهت رسم نمودارها از نرمافزار Excel استفاده شد.

1-3 نتايج بررسي هاي بيوانفورماتيکي
مقدمه
امروزه مطالعات بيوانفورماتيک يکي از ابزارهاي کارآمد در تکنولوژي مهندسي ژنتيک جهت پيش بيني، طراحي، و ساخت پروتئينهاي هيبريد جاذب فلزات سنگين (کادميوم) محسوب ميشود در اين مطالعه با بررسي بانکهاي اطلاعاتي، موتيفهاي متصل شونده به کادميم را شناسايي کرده و از طرف ديگر جايگاههاي مجاز پذيرش پپتيد خارجي (Permesive Site) ژن cstH (زيرواحد ساختاري پيلي CS3) را به کمک سرورهاي پيشگويي کننده، پيشبيني و سپس موتيفهاي فوق الذکر در هر يک از جايگاههاي مجاز وارد شده و با نرمافزارهاي کامپيوتري امکان در سطح قرار گيري آنها را بررسيشد. سپس با فنون مهندسي ژنتيک، توالي موتيف هاي مربوطه در ژن cstH، کلون و پيلي CS3 هيبريد حاوي موتيف و در سطح باکتري عرضه گرديد و جذب فلزات توسط اين سيستمها با کمک روش هاي مناسب مورد مطالعه قرارگرفت.

1-1-3 شناسايي و طراحي موتيف(پپتيد) متصل شونده به فلزات
باکتريهاي مقاوم به فلزات کاربرد فراواني در پاکسازي زيستي دارند که اين توانايي توسط سه سيستم متفاوت، که در بخش مقدمه به آنها اشاره شد، ايجاد مي شود.
در اين تحقيق موتيف(هاي) اتصال به کادميوم از طريق جستجوي نام اين فلز در پايگاهداده Prosite بدست آمد (Falquet et al., 2002).
Prosite، پايگاهدادهاي براي موتيفها و پترنهاست. از جستجو براي موتيفهاي متصل شونده به کادميوم در اين پايگاه چهار سند به شرح زير بدست آمد:
1- PDOC00661 پروفايل و نشان دمينArsR-type HTH87
2- PDOC00804 پروفايلها و نشانهاي دمينهاي متصل شونده به فلزات سنگين88
3- PDOC00139 P-type ATPases89
4- PDOC00180 نشان متالوتيونينهاي مهرهداران90
از چهار سند فوق، سند شماره دو براي ادامه مطالعه انتخاب گرديد. اين سند شامل سه نوع دمين اتصال به فلزات سنگين با شناسه91هاي PS50846، PS01047و PS00154 در جايگاه پروسايت ميباشد. دومين با شناسه PS01047، دومين حفاظت شده با حدود 70 اسيدآمينه ميباشد که در تعدادي از پروتئينهايي که نقش ناقل يا سمزدايي فلزات سنگين را برعهده دارند يافت ميشود. اين دومين که به نام دمين اتصال به فلزات سنگين92 (HMA) ناميده ميشود داراي پترن توافقي (شکل 3-1) با دو سيستئين حفظ شده ميباشد که در اتصال به فلزات سنگين نقش مهمي را ايفا ميکند.
[LIVNS]-x-{L}-[LIVMFA]-x-C-x-[STAGCDNH]-C-x(3)-[LIVFG]-{LV}-x(2)-[LIV]-x(9,11)-[IVA]-x-[LVFYS]
(a )

(b)
شکل3-1.) :(aپترن توافقي دومين اتصال به فلزات سنگين ) (HMA_1،b) 🙁 نمايش لوگوي توالي پترن. دو اسيدآمينه سيستئين احتمالا عامل اصلي اتصال موتيف به فلزات ميباشند.
شناسه PS01047 با کمک ابزار Prosite-Scan موجود در پايگاهداده Prosite در مقابل دو پايگاهداده UniProtKB/Swiss-Prot و UniProtKB/TrEMBL پويش گرديد که 209 پروتئين تا تاريخ آوريل 2009 بدست آمد. برخورد با شناسه Q60048[1-71] متعلق به پروتئين CadA ميباشد اين پروتئين (احتمالا)يک نوع ناقل وابسته به ATP جهت انتقال فلز کادميم در باکتري ليستريا مونوسيتوژنز 93 بوده و در اين تحقيق توالي موتيف اتصالي به کادميوم از آن استخراج گرديد (شکل3-2).
دومين اتصالي (HMA) به فلز کادميوم در پروتئين CadA از 70 اسيدآمينه تشکيل شدهاست وحامل يک توالي توافقي CXXC (در لوپ 1 مابين زنجيره ?1 and ?1) است که در اتصال به کادميوم بسيار کليدي عمل ميکند. لازم به ذکر است که در بسياري از پروتئينهاي اتصالي به فلزات سنگين اين توالي توافقي حضور دارد(شکل 3-2).
دو نوع موتيف اتصالي بر پايه اطلات ساختاري HMA در پايگاهداده PDBsum و نيز اطلاعات موجود در منابع (Banci et al., 2006) از اين بخش پروتئين CadA استخراج و براي قرار دادن در نواحي مجاز زيرواحد اصلي پيلي CS3 در نظر گرفتهشد(شکل 3-2).

(a1): gi|99031832|pdb|2AJ1|A
MAEKTVYRVDGLSCTNCAAKFERNVKEIEGVTEAIVNFGASKITVTGEASIQQVEQAGAFEHLKIIPEKE
(a2)=M: VDGLSCTNCAAKFERNVKEIEGVTEAI
(a3)=?M: VDGLSCTNCAAKFERNVKEIEGVTEAIVNFGASKITVTGEA
(a)

(b) (c)

شکل3-2. توالي و نمودار شماتيک مربوط به دومينHMA _1 در پروتئين CadA با کد پروتئيني PDB: 2AJ1|A و شناسه ژنتيکي gi|99031832
(a): موتيف هاي استخراج و طراحي شده از دومين HMA _1 پروتئين CadA به نام هايm و ?m نامگذاري شدند که در توالي اصلي بصورت ضخيم با خط زيرين نمايش داده شدند و توالي توافقي که نقش مهمي در اتصال به فلزات را دارد بصورت ايتاليک مشخص شدهاست.(b) ساختار دوم دومينHMA _1 پروتيئنCadA، عناصر ساختار دوم موتيفها به ترتيب شامل حلقه – پيچ- حلقه و حلقه – پيچ- حلقه- زنجيره بتا هستند. (C) موقعيت فضايي عناصر ساختار دوم دومين HMA _1 نسبت به يکديگر.

نکته ديگر اين است که ساختار انتهاي آميني پروتئين CadA در حضور و عدم حضور Cd 2+ با کمک اسپکتروسکوپي X-ray و نيز NMR بررسي شده و نشاندادهاند که گلوتامين موقعيت 61 از لحاظ فضايي در مجاورت موتيف CXXC قرار ميگيرد. از طرف ديگر گلوتامين موقعيت 61 در اين دسته از پروتئينها کاملا حفظ شده است (و دريک مورد هم بجاي گلوتامين، اسيدآمينه آسپارژين جايگزين شده است) (شکل3-3 ). لذا بنظر ميرسد اين اسيدآمينه در اتصال اختصاصي موتيف به کادميوم موثر ميباشد، نوآوري دوم در اين تحقيق اين بود که براي جايگاههاي 38 و 79 به ترتيب براي موتيف و بتاموتيف اسيدآمينه آسپاريتک در موقعيت 61 نسبت به موتيف CXXC قرار گرفتهاست.

شکل 3-3. تطابق توالي بر مبناي ساختار دوم در منطقه انتهاي آميني انواع پروتئينهاي دسته

پایان نامه
Previous Entries پایان نامه با واژه های کلیدی هدف گذاری، چند متغیره، مصرف انرژی Next Entries پایان نامه با واژه های کلیدی سلسله مراتب، دینامیکی