تحقیق رایگان درباره عرضه کننده

دانلود پایان نامه ارشد

مختلفي از TraT با موفقيت وارد شدهاست.
(3) ورود تواليهاي هدف بدرون پروتئينهايي که نقش ساختاري در سطح سلول دارند مانند فلاژليوم و پيلي.(Chang et al., 1999, Saleem et al., 2008, Bae et al., 2000)
بطور کلي استقرار و ارائه پروتئين در سطح باکتري با عبور از دو غشا باکتري امکان پذير ميگردد. باکتريها از طريق دو سيستم ترشحي، پروتئينها را به سطح سلول هدايت ميکنند: پروتئينها از(1) مسير جابجايي آرژنين دوتايي يا مسيرtat (2) ويا مسير ترشح عمومي يا sec (Palmer et al., 2005) (de Keyzer et al., 2003) از غشاي داخلي عبور ميکنند سپس پروتئينهاي با مقصد غشاي خارجي60 (OMP) توسط ماشينهاي ويژه نظير برخي از پروتئينهاي پوششي، از پري پلاسم عبور کرده و در غشاي خارجي قرار ميگيرند (Genevrois et al., 2003). در باکتريهاي گرم منفي پروتئين‌هاي سطحي مختلفي شامل پروتئين‌هاي غشاي خارجي مانندLamB ، PhoE وOmpA (Chen and Georgiou, 2002) ليپو‌پروتئين سطحي TraT و ليپوپروتئينهاي متصل به پپتيدوگليکانها (Chang et al., 1999)، پروتئين فلاژلين پيلي باکتريايي (Westerlund-Wikstrom, 2000) و پروتئين فيمبرين تاژک باکتري (Klemm and Schembri, 2000) براي نمايش سطحي پپتيدها در سطح باکتري بکاربرده شدهاست. در ميان پروتيئنهاي ذکر شده، پيليها نسبت به ساير حاملها امتيازاتي دارند که در بخشهاي بعدي به آنها اشاره خواهيم کرد. شکل (1-6) نشان دهنده ارائه سطحي باکتريايي است که با نمايش پروتيئنهاي مختلف در سيستم غشا خارجي تامين ميشود(Samuelson et al., 2002).

شکل1-6. عرضه سطحي در باکتريهاي گرم منفي: دايرههاي سبز نشاندهنده پروتئينهاي هترولوگ مسافر ميباشند.) a ( سيستمهاي عرضه سطحي در باکتريهاي گرم منفي: S-layer protein،OmpC ،PhoA ،OmpA ،lipoprotein ، IgA protease، Pilin،Lpp-OmpA ، OprF، INP61 و Flagella (b) سيستم عرضه سطحي با استفاده از پروتيئن INP، که مثالي از اتصال انتهاي آميني ميباشد. INP يک حامل بسيار پايدار براي عرضه پروتئينهاي خارجي به بزرگي60 کيلو دالتون ميباشد. ( c ) سيستم عرضه سطحي با استفاده از پروتيئن غشاي خارجيC (OmpC)، که نماينده روش اتصال ساندويچي ميباشد.در اين سيستم يک پپتيد پلي هيستيديني با طول بيش از 162 اسيدآمينه در هفتمين لوپ خارجي (L7) پروتيئن OmpC وارد شده و بطور کاملا کارآمد در سطح سلول باکتري.E. coli .بيان شد.

2-12-1 نمايش پروتئينهاي هترولوگ در باکتريهاي گرم مثبت
بيان سطحي در باکتريهاي گرم مثبت نسبت به باکتريهاي گرم منفي داراي يکسري امتيازاتي است که از آنجمله ميتوان به مواردي مانند: کوتاه بودن مسير انتقال پپتيدها از سيتوپلاسم به سطح سلول، نيز ضخيم و مقاوم بودن ديواره سلولي باکتريهاي گرم مثبت نسبت به استرسهاي مکانيکي اشاره نمود (شکل1-5). از اينرو بنظر ميرسد باکتريهاي گرم مثبت نسبت به باکتريهاي گرم منفي جهت کاربردهاي زيستفناوري مناسبتر باشند (Narita et al., 2006, Lee et al., 2003).
همانند E. coli در ميان باکتريهاي گرم مثبت، باکتريهاي Staphylococcus Xylosus و Staphylococcus carnosus بيشتر مورد مطالعه قرار گرفتهاند. پروتيئن SpA62 از باکتري S. auresus و پروتئين PgsA از باکتري Bacillus subtilis. بيشتر از ساير پروتئينها بعنوان سيستم مهندسي سطح سلول استفاده شدهاند. با همه امتيازات ذکر شده مطالعات کمتري در مورد بيان سطحي باکتريهاي گرممثبت بخصوص در زمينه کاربرد در پاکسازي زيستي صورت گرفتهاست. در اين خصوص ميتوان به بيان دو پپتيد پلي هيستيديل، His3-Glu-His3 و His6 در سطح دو باکتري S. xylosus and S. carnosus اشاره نمود که براي اولين با توسط Samuelson انجامگرفت و نشان دادند که پپتيدهاي عرضه شده قادر به اتصال به دو فلز نيکل و کادميوم ميباشد(Samuelson et al., 2000). با اين حال مستندات کمتري از کاربرد باکتريهاي گرم مثبت جهت حذفزيستي موجود است اما بنظر ميرسد بدليل برتريهاي اين باکتريها براي مهندسي سطح سلول در آينده اين استراتژي مورد توجه بيشتري قرار گيرد (Saleem et al., 2008).

13-1 افزايش جذبزيستي فلزات سنگين در باکتريهاي گرم منفي با روش¬هاي مهندسي ژنتيک با تاکيد بر نمايشسطحي
تا کنون انواع مختلفي از پروتئينهاي اتصالي به فلزات مانند گلوتاتيون، فيتوچلاتينهاي وابسته به گلوتاتيون و متالوپروتئينهاي غني از سيستئين و فيتوچلاتينهاي سنتزي براي افزايش جمعآوري و تجمع فلزات سنگين استفاده شدهاست.
Kotrba و همکارانش در سال 1999 خواص اتصال به فلزات، سويههاي ارائه کننده پپتيدهاي کوچک بصورت فيوژن با LamB در سطح را بررسيکردند. آنها در اين بررسي تواليهاي کوچک متصلشونده به فلز مانند HP وCP (Gly-Cys -Gly-Cys-Pro-Gly-Cys-Gly-Cys) که به روش مهندسي ژنتيکي درون پروتئين LamB قرارداده شده بود را در سطح باکتري E. coli بيان کردند و نشان دادند که قدرت جذب Cu+2 و Zn +2نسبت به حالت وحشي 4 برابر بيشتر بود(Kotrba et al., 1999b).
در سال 2000 ، Bae و همکارانش فيتوچلاتينهاي سنتزي (ECs) را جهت افزايش جمعآوريزيستي Cd+2 استفاده کردند. آنها بدين منظور ژنهاي سنتزي آنالوگهاي فيتوچلاتين(Glu-Cys)n Gly (EC8 (n = 8), EC11 (n = 11), و EC20 (n = 20))را به ژن Lpp-ompA فيوز کرده و در سطح باکتري E.coli ارائه نمودند و نيز EC20را بصورت پريپلاسمي در باکتري بيان کردند. نتايج نشان داد که به ازاي 1 ميلي گرم وزن خشک سلول ارائه دهنده EC8 ، 18 ميلي گرم +2 Cdجذب ميشود در حالي که در سلولهاي ارائه کننده EC20 بيش از 100 ميليگرم Cd+2به ازاي يک ميليگرم وزن خشک سلول جمعميگردد و همچنين ميزان جذب سلولهاي عرضه کننده EC20 بصورت سطحي نسبت به سلولهاي عرضه کننده EC20 بصورت پري پلاسمي 2 برابر بود(Bae et al., 2000).
Valls براي اولين بار متالوتيونين را جهت جذب کادميوم از خاکهاي آلوده در سطح باکتري Ralstonia eutropha معرفيکرد. در اين مطالعه توالي DNA کد کننده متالوتيونين به دومين بتاي اوتوترانسپورتر، پروتئاز IgA ازباکتري Neisseria gonorrhoeae متصل شد و بدين ترتيب پروتئين هيبريد به سطح غشاي خارجي هدايت گرديد. نتيجه اين بررسي نشان داد که سويه دستکاري شده ژنتيکي مقدار بيشتري کادميوم از محيط مايع جمع ميکند و جالب اينکه تلقيح R. eutropha بيان کننده متالوتيونين به خاک آلوده به کادميوم بطور قابل ملاحظهاي سميت اين فلز را در گياه تنباکو کاهش داد(Saleem et al., 2008).
در سال 2001، Kjaergaard و همکارانش يک پپتيد جديد متصل شونده به فلز روي (Zn2+) را از کتابخانه پپتيدي بر پايه پيلي FimH گزارش کردند(Kjaergaard et al., 2001).
در تمامي مطالعات فوق که اغلب شامل پپتيدهاي غني از سيستئين بودند يک مسئله عمده فقدان اختصاصيت بود که مشکل بزرگ در بازيافت اختصاصي فلزات سنگين مانند جيوه بوجود ميآورد. جهت بررسي اختصاصيت جذب از ويژگي باکتريهاي مقاوم به جيوه استفاده کردند. مطالعات نشان دادهاست برخي از باکتريهاي مقاوم به جيوه داراي يک اپرون جيوه ميباشند که شامل يک ژن تنظيمي MerR و ساير ژنهاي دخيل در انتقال و سمزدايي يون جيوه درون سلول است. پروتئين MerR داراي سه دمين ميباشد که (1) دمين انتهاي آميني به DNA اتصال يافته (2) دمين انتهاي کربوکسيلي به Hg2+ و منطقه مابين که عملکرد آن هنوز شناخته نشدهاست. اختصاصيت اين پروتئين براي اتصال به Hg2+ با تشکيل آرايش سه وجهي تيولات با مرکزيت جيوه تامين ميشود(O’Halloran et al., 1989).
در سال 2003 Bae و همکاران با عرضه MerR در سطح باکتري E. coli آنرا براي جذب اختصاصي جيوه از محيط بکاربردند و نشان دادند عرضه سطحي MerR ظرفيت جذب يون جيوه را به ميزان 6 برابر نسبت به باکتريهاي مهندسي نشده، افزايش ميدهد و جالب اينکه اين اتصال بسيار اختصاصي بوده بطوريکه در حضور 100برابر غلظت اضافي کادميوم و روي، هيچ کاهشي در اختصاصيت و اتصال فلز جيوه به MerR مشاهده نشد و نکته جالب ديگر اينکه اين اتصال همچنين نسبت به pH و ساير کلاترهاي فلزي مقاوم ميباشد(Bae et al., 2003).
در سال 2006، Qin و همکارانش خواص بيوشيميايي و فيزيولوژيکي يک پلي پپتيد واجد دمين اختصاصي اتصالي به فلز63 (MBD ) را با بيان کردن در سطح سلول و نيز در سيتوزول مورد بررسي و ارزيابي قراردادند. آنها بدين وسيله ميخواستند محيطي که در آن جذب اختصاصي رخ ميدهد را شناسايي و بررسي نمايند. لذا دمين اتصالي به فلز64 را بصورت فيوز شده با Lpp-ompA تحت کنترل AraC در سطح سلول بيان کردند و توانايي اين دمين اتصالي از لحاظ اتصال به فلزات و حفاظت سلول در برابر ا ثرات سمي جيوه را مورد بررسي قرار دادند و مشاهده کردند علاوه بر داشتن تمايل بالا نسبت به جذب جيوه، از اختصاصيت بالايي نيز برخودار هستند بطوريکه که حتي در حضور غلظتهاي بالاي کادميوم و روي با تمايل و اختصاصيت بيشتري جيوه را جذب ميکردند.
همچنين محققين پپتيدهاي اختصاصي را از طريق غربال کتابخانهاي که حامل پپتيدهاي اتصالي براي نيکل بود، جدا کرده، و نشان دادند اسيدهاي آمينه هيستيدين و آرژنين در اتصال به نيکل مشارکت دارند(Kjaergaard et al., 2001, Dong et al., 2006).
در سال 2007 Saffar و همکاران با ارائه هگزا هيستيدين بر روي سطح باکتريE. coli نشان دادند که ميزان جذب نيکل و کادميوم در باکتريهاي نوترکيب نسبت به باکتريهاي دستنخورده به ميزان چشمگيري افزايش مييابد(Saffar et al., 2007).
از اين مطالعات ميتوان نتيجهگيريکرد که با ارائه پپتيدهاي جاذب فلزات سنگين از طريق وارد نمودن و بيان آنها در پروتيئنهاي سطحي ميتوان فلزات سنگين را از محيط جدا نمود. در ميان پروتئينهاي حامل ذکر شده، پيليها نسبت به ساير حاملها امتيازاتي دارند که از آنجمله ميتوان به مواردي مانند گسترش به بيرون از غشا، دسترسي آسان به محيط و فراوان بودن تعداد آنها در سطح سلول اشاره نمود. لذا در اين مطالعه از پيلي CS3 براي ارائه پپتيد خارجي در سطح باکتري E. coli استفاده شدهاست که در ادامه به سازکار تشکيل پيليهاي باکتريايي بطور کلي وجزئيات ساختاري (ژنتيکي و پروتئيني) پيلي CS3 اشاره خواهيم کرد.
لازم به ذکر است علارغم مطالعات وسيعي که در سطح آزمايشگاهي انجام گرفته متاسفانه اکثر اين مطالعات فاقد اطلاعات لازم راجع به چگونگي عملکرد جاذبهاي زيستي در شرايط متنوع دنياي واقعي هستند لذا تنظيمات بسيار اساسي و مطالعات دقيق جهت توسعه موفقيتآميز جاذبهاي زيستي براي کاربردي کردن آنها موردنياز ميباشد.
14-1 سازکار تشکيل پيلي باکتريايي
زيرواحدهاي پيليها مانند بسياري از پروتئينهاي ساختاري مونتاژي، داراي توالي نشانه انتهاي آميني هستند که امکان انتقال آنها به پريپلاسم را از طريق مسير ترشحيSec فراهم ميکند. بعد از برش توالي نشانه، زير واحدهاي پيلي، پيلين(Pilin) با کمک چاپرون مربوطه، تاخوردگي و ساختار فضايي نهايي خود را بدست ميآورند. علي رغم پايين بودن همولوژي بين تواليهاي پيليهاي مختلف، همه زيرواحدهاي پيلي ساختار شبه ايمونوگلوبيني دارند با اين تفاوت که زنجيره بتاي موازي با جهت مخالف (زنجيره G) در پيليها وجود ندارد که همين امر يک شکاف آبگريزي در ساختار زيرواحد اصلي پيليها بوجود ميآورد که بدون حضور چاپرون يا نسخههاي زيرواحد اصلي اين ساختار ناپايدار ميباشد. در پري پلاسم زنجيره بتاي G1 چاپرونها (زنجيره دهنده) بصورت موازي وارد شکاف هيدروفوبي شده و بدين ترتيب ساختار غير کلاسيک شبه ايمونوگلولين بوجود ميآورند. انتهاي آميني زيرواحدهاي اصلي پيلي، شامل زنجيره ? حفاظت شده ميباشد که شباهت زيادي به زنجيره بتاي دهنده G1 (G1 donor ?-strand) چاپرونها دارد. مونتاژ زيرواحدها از طريق واکنش جابجايي که در آن زنجيره بتاي انتهاي آميني زيرواحد دوم با آرايش ضدموازي و مطلوب از لحاظ انرژي با زنجيره بتاي دهنده G1 متعلق به چاپرون با آرايش موازي جايگزين شده و بدين وسيله ساختارکلاسيک شبه گلوبوليني حاصل ميشود. واکنشهاي جايگزيني و اتصال زيرواحدهها تا تشکيل فيبرهاي کامل ادامه مييابد شکل (1-7).
لازم به ذکر است که فيبرها ممکن است بصورت

پایان نامه
Previous Entries تحقیق رایگان درباره سنگين، پروتئين، پروتئينهاي Next Entries تحقیق رایگان درباره پيلي، CS3، زيرواحد