تحقیق رایگان درباره عرضه کننده

دانلود پایان نامه ارشد

خشک باکتري رسيدهاست بعبارت ديگر باکتريهاي نوترکيب افزايش 8/1 برابري جذب کادميوم نسبت به سلولهاي کنترل نشان ميدهند.
Xu و Lee در سال 1999 توالي هگزاهيستيدين را با تعداد 1،2 ،3 و6 عدد وارد پروتئين OmpC باکتري E. coli نمودند. ميزان جذب کادميوم در اين باکتريهاي نوترکيب به ترتيب 1/26 ،9/23، 9/18و nmol/mg32وزن خشک سلول در مقايسه با باکتري طبيعي با ميزان جذب nmol/mg3/10 بود (Xu and Lee, 1999).
Samuelson و همکارانش در سال 2000 باکتريهاي نوترکيب S.xylosus و S.carnosus ايجاد کردند که روي ديواره سلولي آنها پپتيد هگزاهيستيدين با دو نوع تواليHis3-Gly-His3 و His6 بيان ميشد. اين باکتريهاي نوترکيب قادر به جذب يونهاي نيکل و کادميوم بودند(Samuelson et al., 2000).
دسته ديگري از پپتيدهاي متصل شونده به فلزات سنگين، فيتوکلاتينهاي سنتزي (Glu-Cys)nGly ميباشند که تمايل بيشتري نسبت به MTها جهت اتصال به کادميوم دارند.در سال 2000، Bae و همکارانش فيتوکلاتينهاي سنتزي (Glu-Cys)n Gly) را جهت افزايش جمع آوري زيستي Cd+2 استفاده کردند آنها بدين منظور ژنهاي سنتزي آنالوگهاي فيتوکلاتين با تواليهايEC8 (n = 8), EC11 (n = 11), و EC20 (n = 20))به ژن Lpp-ompA متصلکرده و در سطح باکتري E. coli عرضه نمودند و در کار ديگري EC20 را بصورت پريپلاسمي در باکتري بيانکردند . نتايج نشان داد که ميزان جذب يون کادميم در سلولهاي نمايش دهنده EC8 و EC20 به ترتيب nmol/mg18 و nmol/mg 60 وزن خشک باکتري ميرسد همچنين ميزان جذب سلولهاي عرضهکننده EC20 بصورت سطحي نسبت به سلولهاي عرضه کننده EC20 بصورت پريپلاسمي 2 برابر بود(Bae et al., 2000). در سال 2002 Bae و همکارانش فيتوکلاتين سنتزي EC20 را با استفاده از Lpp-OmpA روي سطح باکتري E.coli بيان کرده ونشان دادند که بيان پروتيئن هيبريد باعث افزايش جذب کادميوم و جيوه ميگردد.(Bae et al., 2002).
Valls و همکارانش در سال 2000 براي اولين بار متالوتيونين را جهت جذب کادميم از خاکهاي آلوده در سطح باکتري Ralstonia eutropha بيان کردند در اين مطالعه توالي DNA کد کننده متالوتيونين به دومين ? اوتوترانسپورتر، پروتئاز IgA از Neisseria gonorrhoeae متصل شد و بدين ترتيب پروتئين هيبريد به سطح غشاي خارجي هدايتگرديد. نتيجه اين بررسي نشانداد که سويه دستکاري شده ژنتيکي eutropha R. مقدار بيشتري کادميم را از محيط مايع جمع ميکند و جالب اينکه تلقيح eutropha R. بيان کننده متالوتيونين به خاک آلوده به کادميم بطور قابل ملاحظهاي سميت اين فلز براي گياه تنباکو را نيز کاهش داد(Valls et al., 2000). تحقيق ديگري در سال 2006 جهت بررسي اثر بيان EC20 در باکتري سودوموناس حاکي از افزايش جذب کادميم ميباشد (Saleem et al., 2008).
در بررسي ديگري در سال 2006، Deng و همکارانش سيستم انتقال يون کادميوم را به همراه متالوتيونين در باکتري E .coli بيان کردند و نشاندادند که در باکتريهاي مهندسي شده ميزان جذب کادميوم نسبت به باکتري کنترل 6 برابر افزايش مييابد. جدول4-1 خلاصهاي از مقايسه ميزان جذب يون کادميوم در اثر ورود پپتيد در سيستمهاي مختلف و نتايج اين مطالعه نشان ميدهد.
در اکثر اين مطالعات که اغلب هم از متالوتيونينها، فيتوکلاتينهاي سنتزي و پپتيدهاي غني از سيسئين و هيستيدين استفاده ميشود اشکال عمده اين پپتدها فقدان اختصاصيت در آنها ميباشد که منجر ميشد سيستم نتواند بين کاتيونهاي مانندCd2+ ، Hg2+، Pb2+ ، Cu2+ و Zn2+ تفکيک قائل شود. اين امر مشکلات زيادي را بخصوص در بازيافت فلزات بوجود مي آورد .(Saleem et al., 2008) به عنوان مثال MBP استفادهشده در اين تحقيقات علاوه بر جذب کادميوم، فلزاتي مانند مس و نيکل را نيز به همان ميزان يا در مقادير بيشتري جذب مينمايد (5/276، 2/656 و 4/1137 به ترتيب براي يونهاي نيکل، کادميوم و مس) (Saffar et al., 2007). در برخي موارد براي رسيدن به اختصاصيت از ارائه کتابخانه پپتيدي روي سطح ريزسازوارههاي استفاده ميکنند که اين روشها علارغم مهيا کردن امکان گزينش ليگاندهاي جديد و اختصاصي Ahalya N, 2003, Bae, 2000)) ولي به سبب اينکه هزينه و زمان زيادي بايد صرفشود، مطلوب نميباشند. بطورکلي از اين نتايج ميتوان چنين استنتاج کرد که شايد بکارگيري موتيفهاي اختصاصي جهت حذف اختصاصي فلزات بهترين و مناسبترين راه حل براي برطرف کردن اين نقيضه باشد و بتواند با اختصاصيت و تمايل بيشتري يون کادميوم را جذب نمايد و در حذف و پالايش آلودگي پسابهاي حاوي اين دسته از فلزات بکاررود. لذا در اين مطالعه ما روشهاي مهندسي ژنتيک را با ديدگاهها و مسيرهاي بيوانفورماتيکي تلفيق کرده و در نتيجه موتيفهاي اتصالي اختصاصي به فلزات سنگين را طراحي کرديم و نشان داديم نه تنها باکتريهاي داراي پلاسميد هاي نوترکيب کادميوم بيشتري نسبت به سويههاي کنترل فاقد موتيف جذب ميکنند بلکه نسبت به کادميوم اختصاصي نيز عمل ميکنند. نکته قابل تامل در موتيفهاي استفادهشده در اين تحقيق علاوه بر ويژگي خاص آنها، وجود دو اسيدآمينه سيستئين و همچنين اندازه نسبتا بزرگ آنها (27 و 41 اسيدآمينهاي) ميباشد. بررسي هاي نتايج وسترن بلات پيليهاي نوترکيب نسبت به پيلي وحشي نشان ميدهد که ميزان بيان پيليهاي نوترکيب در حدود يک هشتم تا يک دهم پيلي هاي وحشي ميباشد. لذا با توجه به مطالب ارائهشده در بخشهاي قبلي مبني تاثير ترکيب اسيدآمينهاي و اندازه پپتيدهاي ورودي بر ميزان بيان، در اينجا نيز احتمالا کاهش بيان متاثر از حضور اسيدهايآمينه سيستئين و همچنين اندازه تا حدي بزرگ پپتيدهاي بياني ميباشد. بنابراين به نظر ميرسد که اگر مقدار مساوي از پيليهاي موتانت و نيز پيليهاي دست نخورده در يک آزمايش جذب فلز استفادهگردد ميزان جذب کادميوم پيلي موتانت نسبت به پيلي دست نخورده بسيار بيشتر ميگردد.

4-1. مقايسه ميزان جذب يون کادميم در سيستمهاي نمايش سطحي مختلف و نتايج حاصل از اين تحقيق
منابع
ميزان جذب يون کادميم
( nmol/mg of cells [dry wt])
پپتيد وارد شده
سيستم نمايش دهنده
(Bae et al.2000)

60
(Glu-Cys)20Gly
Lpp-OmpA
(Bae et al.2000)

18
(Glu-Cys)8Gly
Lpp-OmpA
(Tafakori et al 2012)

20.35
SmtA-ChBD
Lpp-OmpA
(Tafakori et al 2012)

26.4
MtnA-ChBD
Lpp-OmpA
Sousa et al.1996

7±2
(His6)1
LamB
(Xu &Lee.1999)
18.9.
(His6)1
OmpC
(Xu &Lee.1999)

26.1
(His6)3
OmpC
(Xu &Lee.1999)

32
(His6)6
OmpC
(Saffar.2005)

652
(His6)1
CS3
(Saffar.2005)

510
MBP
CS3
(Kotrba et al.1999)

196
(HP)1
LamB
(Sousa et al.1998)

30±4
Metallothionein
LamB
This work

173.6
a38cbm
CS3
This work

141.6
38cb?m
CS3
This work

103.2
66cbm
CS3
This work

177.6
79cbm
CS3
This work

127.2
79cb?m
CS3
This work

206.4
92cbm
CS3
This work

204.8
107cbm
CS3
This work

137.6
107cb?m
CS3

در چند مورد آخر عدد موجود در نام پپتيد وارد شده، نشاندهنده شماره اسيد آمينه محل ورود پپتيد جاذب فلز سنگين ميباشد

همچنانکه که پيشتر نيز اشارهشد هدف اصلي اين تحقيق همراه کردن روشهاي نوين بيوانفورماتيکي با متدهاي مهندسي ژنتيک جهت طراحي موتيفهاي اختصاصي اتصالي به فلزات و يافتن مکانهاي مجاز ورود اين پپتيدها درپيلي CS3 و عرضه آن در سطح باکتريE .coli به منظور جذب و حذف فلزات سنگين (کادميوم) بود که با موفقيت انجام پذيرفت. اما بهينه سازي رشد باکتري، افزايش ميزان جذب فلزات، تثبيت باکتري، مشاهده فلزات انباشت شده با ميکروسکوپ الکتروني، تثبيت باکتري، تهيه بيوفيلترو در نهايت کاربردي کردن استفاده از اين باکتري در تصفيه فاضلاب هاي صنعتي از جمله مواردي است که به بررسي و مطالعه بيشتر در اين زمينه نياز دارد.

4-4 پيشنهادات
1- تثبيت پروتئين يا باکتري نوترکيب روي سطح مناسب جهت افزايش مقاومت سلول يا پروتئين جاذب در برابر فشارها و استرسهاي محيطي.
2- بررسيهاي بيوانفورماتيکي جهت رسيدن به مناسبترين ماتريکس از لحاظ قدرت اتصال به پروتئين پيلي سپس بررسي آنها در آزمايشگاه.
3- بررسي توليد جاذبهاي جديد براي کادميوم و يا ساير فلزات سنگين و ارزشمند با کمک روشهاي نرمافزاري مشابه اين تحقيق سپس بررسي آنها در آزمايشگاه.
4- تغيير راهانداز پيلي CS3 براي رشد انبوه اين باکتري با القاگرهاي ساده و يا جهت رشد اين باکتري در محيطهاي ارزان قيمت
5- طراحي محيطهاي کشت جديد ارزان قيمت.
6- بررسي بيوانفورماتيکي زيرواحدهاي پيلي و ايجاد جهش احتمالي در آن جهت رسيدن به بيشترين قدرت اتصال بين زيرواحدها به منظور افزايش مقاومت پيلي در برابر فشارها و استرسهاي محيطي.
7- انتقال سازههاي ژني به يک ميزبان مناسب و مقاومتر جهت کاربرد در پسابهاي صنتعتي.

منابع

AHALYA N, R. T., KANAMADI RD (2003) Biosorption of Heavy Metals. Res. J. Chem. Environ, 7, 71-8.
ANANTHA, R. P., MCVEIGH, A. L., LEE, L. H., AGNEW, M. K., CASSELS, F. J., SCOTT, D. A., WHITTAM, T. S. & SAVARINO, S. J. (2004) Evolutionary and functional relationships of colonization factor antigen i and other class 5 adhesive fimbriae of enterotoxigenic Escherichia coli. Infect Immun, 72, 7190-201.
BAE, W., CHEN, W., MULCHANDANI, A. & MEHRA, R. K. (2000) Enhanced bioaccumulation of heavy metals by bacterial cells displaying synthetic phytochelatins. Biotechnol Bioeng, 70, 518-24.
BAE, W., MULCHANDANI, A. & CHEN, W. (2002) Cell surface display of synthetic phytochelatins using ice nucleation protein for enhanced heavy metal bioaccumulation. J Inorg Biochem, 88, 223-7.
BAE, W., WU, C. H., KOSTAL, J., MULCHANDANI, A. & CHEN, W. (2003) Enhanced mercury biosorption by bacterial cells with surface-displayed MerR. Appl Environ Microbiol, 69, 3176-80.
BAIROCH, A. (1992) Prosite: a dictionary of sites and patterns in proteins. . Nucleic Acids Research., 20, 2013-2018.
BAIROCH, A., APWEILER, R., WU, C. H., BARKER, W. C., BOECKMANN, B., FERRO, S., GASTEIGER, E., HUANG, H., LOPEZ, R., MAGRANE, M., MARTIN, M. J., NATALE, D. A., O’DONOVAN, C., REDASCHI, N. & YEH, L. S. (2005) The Universal Protein Resource (UniProt). Nucleic Acids Res, 33, D154-9.
BANCI, L., BERTINI, I., CIOFI-BAFFONI, S., SU, X. C., MIRAS, R., BAL, N., MINTZ, E., CATTY, P., SHOKES, J. E. & SCOTT, R. A. (2006) Structural basis for metal binding specificity: the N-terminal cadmium binding domain of the P1-type ATPase CadA. J Mol Biol, 356, 638-50.
BANSAL, A. K. (2005) Bioinformatics in microbial biotechnology–a mini review. Microb Cell Fact, 4, 19.
BARDWELL, J. C. (1994) Building bridges: disulphide bond formation in the cell. Mol Microbiol, 14, 199-205.
BELTRAN HEREDIA, J. & SANCHEZ MARTIN, J. (2009) Removing heavy metals from polluted surface water with a tannin-based flocculant agent. J Hazard Mater, 165, 1215-8.
BENSON, D. A., KARSCH-MIZRACHI, I., LIPMAN, D. J., OSTELL, J. & SAYERS, E. W. (2011) GenBank. Nucleic Acids Res, 39, D32-7.
BERNARD, A. (2008) Cadmium & its adverse effects on human health. Indian J Med Res, 128, 557-64.
BOUTET, E., LIEBERHERR, D., TOGNOLLI, M., SCHNEIDER, M. & BAIROCH, A. (2007) UniProtKB/Swiss-Prot. Methods Mol Biol, 406, 89-112.
BRADFORD, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 72,

پایان نامه
Previous Entries تحقیق رایگان درباره پروتئين، پپتيدهاي، ساير Next Entries تحقیق رایگان درباره (2003)، C.,، (2006)