تحقیق درباره g، اسپورزایی، 9/6، بذردهی

دانلود پایان نامه ارشد

ر پروپانول و پروپیونیک اسید در تولید اریترومایسین به روش Fed Batch توسط Saccharopolyspora erythraea که در سال 1387 توسط لیلا خضروی به راهنمایی حسین عطار و جواد حامدی در دانشکده فنی و مهندسی دانشگاه آزاد واحد علوم و تحقیقات انجام شد. در این پژوهش اثر پروپانول و پروپیونیک اسید که به عنوان پیش‌سازهای تولید اریترومایسین از گونه‌های وحشی Saccharopolyspora erythraea PTCC1685 و جهش یافته Saccharopolyspora erythraea NUR001 در فرآیند غیر مداوم و غیر مداوم خوراک‌دهی شده بررسی شده است. نتایج بدست آمده بدین صورت بوده است که در صورت استفاده از سویه وحشی، با اضافه کردن 1 درصد پروپانول در روز ششم فرآیند تخمیر میزان تولید اریترومایسین نسبت به محیط شاهد 25 درصد افزایش داشته است. اما این افزایش در سویه جهش یافته در همین شرایط اثر قابل توجهی نداشته است. افزودن مقادیر زیاد پرانول در تولید اریترومایسین در هر دو سویه اثر منفی داشته است. همچنین افزودن پروپیونیک اسید موجب کاهش میزان تولید اریترومایسین نسبت به محیط شاهد بوده است.( خضروی ،1387)

فصل سوم

3-1) میکروارگانیسم مورد استفاده
باکتری مورد استفاده Saccharopolyspora erythreae با PTCC 1685 است که از مرکز کلکسیون قارچ‌ها و باکتری‌های صنعتی و عفونی ایران تهیه شد.

3-2) معرف‌های رنگی مورد استفاده
از آنجایی که در این پروژه برای تعیین مرفولوژی و همچنین تشخیص آلودگی و شکل رشد میسلیومی، اسلاید تهیه شده و از روش رنگ آمیزی گرم برای رنگ آمیزی اسلایدها استفاده می‌شود، بنا‌بر‌این باید قبل از شروع آزمایشات معرف‌های رنگی لازم را تهیه کرد(12).
محلول کریستال ویوله
محلول گرم یدین
محلول رنگ بر استن – الکل
محلول سافرانین

3-3) مواد لازم برای سنجش غلظت اریترومایسین
3-3-1) تهیه بافر pH 9/6
برای تهیه ml 200 بافر pH 9/6 باید ml 25 محلول 2/0 مولار کربنات سدیم را با ml 50 محلول 2/0 مولار بیکربنات سدیم و ml 125 آب مقطر مخلوط کرده و با pH متر، pH آن را اندازه می‌گیریم. چنانچه pH برابر 6/9 نبود از کربنات سدیم و یا بیکرینات سدیم کمی اضافه کرده و هم می‌زنیم و pH را اندازه می‌گیریم. این کار تا زمانی که pH برابر 6/9 گردد ادامه دارد(18).
3-3-2) تهیه بافر pH 4/2
برای تهیه ml 450 بافر pH 4/2 ، ml 215 محلول 2/0 مولار Na2HPO4 و ml 235محلول 1/0 مولار اسید سیتریک را با هم مخلوط می‌کنیم و سپس با استفاده از pH متر، pH آن را اندازه می‌گیریم. چنانچه pH برابر 2/4 نبود، مقدار کمی Na2HPO4 برای بالا بردن pH و یا مقداری اسید سیتریک برای پائین آوردن pH به محلول اضافه کرده، همزده و pH را اندازه می‌گیریم. این کار تا زمانی که PH برابر 2/4 گردد ادامه می‌دهیم(18).
3-3-3) تهیه کلرفرم اشباع از بافر pH 9/6 و بافر pH 9/6اشباع از کلرفرم
با توجه به اینکه کلرفرم و بافر(آب)، گرچه به مقدار جزئی، ولی قابلیت امتزاج را دارند برای جلوگیری از تداخل در استخراج و جلوگیری از تغییر حجم و غلظت که موجب خطا در واکنش می‌شود، باید از کلرفرم اشباع از بافر pH 9/6 و نیز بافر pH 9/6 اشباع از کلرفرم استفاده شود. بدین منظور در یک دکانتور با حجم lit 2به مقدار مساوی (ml500)کلرفرم و بافر pH 9/6 ریخته و به مدت چند دقیقه (10 دقیقه) به شدت تکان می‌دهیم تا مخلوط شوند سپس اجازه می‌دهیم تا لایه های آبی و آلی از هم جدا شوند(برای اطمینان به مدت چند روز اجازه می‌دهیم تا دو فاز از هم جدا شوند).
در حالتی که دو فاز از هم جدا هستند فاز رویی(آبی) بافر pH 9/6 اشباع از کلرفرم و فاز زیری (آلی) کلرفرم اشباع از بافر pH 9/6 است. دو فاز را از هم جدا کرده و تا زمان استفاده در ظروف شیشه‌ای درب دار نگهداری می‌کنیم(18و 12).
شکل (3-1): روش تهیه کلرفرم اشباع از بافر و بافر اشباع از کلروفرم
3-3-4) تهیه محلول برمو فنل بلو
با توجه به اینکه برمو فنل بلو(BPB) خوب در آب حل نمی‌شود، بنابراین از اتانل به عنوان کمک حلال استفاده می‌شود چون هدف تهیه محلول ذخیره (BPB 0/4 mg/ml (STOCK می‌باشد. بنابراین mg 43 برموفنل بلو(BPB) توزین شده و با ml 108اتانل20% به شرح زیر با هم مخلوط می‌شوند:
ابتدا به برموفنل بلو توزین شده حدود ml 50 اتانل20% در داخل یک ارلن اضافه کرده و ارلن حاوی BPB و اتانل را برای همزدن روی شیکر مغناطیسی می‌گذاریم. بعد از چند دقیقه همزدن حدود ml 40 اتانل20% دیگر اضافه کرده و به مدت یک ساعت اجازه می‌دهیم تا همزدن ادامه پیدا کند، بقیه اتانل نیز در طول همزدن اضافه می‌شود. جهت جلوگیری از تبخیر اتانل، دهانه ارلن با فویل مسدود می‌گردد. لازم به توضیح است که یک ساعت همزدن جهت اطمینان از حل شدن BPB در حلال است و عمل انحلال در 20-30 دقیقه نیز صورت می‌گیرد.
برای تهیه محلول کار BPB، ml 20 از محلول ذخیره BPB را با ml 80 بافر pH4/2 مخلوط می‌کنیم. بافر pH4/2 مناسبترین pH برای تشکیل کمپلکس BPB و اریترومایسین است(18و12).

3-4) محیطهای کشت اسپوریزاسیون
ترکیب محیط کشت اسپوریزاسیون عمدتاً موجب رشد اسپور می‌شود و رشد میسلیومی در این مرحله کمتر دیده می شود.در زیر فرمولاسیون محیط کشت اسپورزایی برای حجم cm31000 در جدول (3-1) لیست شده است.

3-4-1) محیط اسپورزایی
در تهیه این محیط کشت، با توجه به محلول بودن کم کربنات کلسیم در آب، ابتدا کربنات کلسیم را با مقدار کمی آب از کل مقدار آبی که مورد نیاز است، در یک بشر مخلوط کرده و به آن مگنت اضافه نموده و آن را به مدت 30 دقیقه روی یک همزن – گرمکن مغناطیسی (Heater- Stirrer) قرار می‌دهیم تا کربنات کلسیم کاملاً در آب حل شود و یک سوسپانسیون یکنواخت ایجاد شود.
همچنین محلول میکروالمنت نیز بطور جداگانه با توجه به فرمول ذکر شده در جدول (3-2) تهیه می‌گردد.
در نهایت فانل‌های حاوی محیط اسپورزایی را روی سطح مناسب طوری قرار می‌دهیم تا آگار به صورت شیب دار بسته شود. این عمل باعث افزایش سطح آزاد محیط می‌گردد.

جدول (3-1) : ترکیبات محیط کشت اسپورزایی (3)
مقدار
ماده
g 10
Corn sleep liquid
g 10
Starch
g 5/2
CaCO3
g 3
(NH4)2SO4
g 3
NaCl
g 20
Agar
ml 2
Microelement Solution
ml 1000
Distilled water

جدول(3 -2): ترکیبات محلول میکروالمنت (3)
مقدار
ماده
g 100
MgSO4 , 7H2O
g 2
FeSO4 , 7H2O
g 2
ZnSO4 , 7H2O
g 4/0
CuSO4 , 5H2O
g 1/0
C0Cl2 , 6H2O
ml 1
Hcl 37%
ml 1000
Distilled water

با توجه به میزان محیط لازم، مقادیر هر یک از مواد محیط کشت را از جدول(1-3) محاسبه کرده و در بشر حاوی کربنات کلسیم ریخته و تا حل شدن کامل آگار حرارت داده و همزده می‌شود. بعد از یکنواخت شدن، بشر مدتی در درجه حرارت آزمایشگاه قرار داده می‌شود تا کمی سرد شده و سپس pHآن سنجیده می‌شود.
PH =7/0 ± 0.1 محیط کشت قبل استریلیزاسیون
لازم به ذکر است که برای تنظیم pH از سود و اسید سولفوریک استفاده می‌شود.
تعدادی بطری درپیچ‌دار (فانل) 150 میلی‌لیتری آماده کرده و در هرکدام به اندازه 30 میلی‌لیتر از محیط اسپورزایی تهیه شده می‌ریزیم. درب آنها را بسته و برای استریل کردن، آنها در فشار atm 1و دمای Cْ121 به مدت 15 دقیقه اتوکلاو می‌کنیم.
در نهایت فانل حاوی محیط اسپورزایی را طوری روی میز آزمایش قرار می‌دهیم تا آگار به صورت شیب‌دار بسته شود. این عمل باعث افزایش سطح آزاد محیط می‌گردد.
بعد از بسته شدن محیط کشت جامد، در شرایط استریل در زیر هود بیولوژیک و در کنار شعله، باکتری S.erythraea را روی سطوح محیط اسپورزایی کشت داده و برای مدت 10 الی 14 روز در انکوباتور با دمای c ْ 30 قرار می‌دهیم(18).

شکل(3-2): محیط اسپورزایی در روز چهارم انکوباسیون شکل(3-3): محیط اسپورزایی در روز چهاردهم انکوباسیون

3-4-1-1) باز کردن آمپول لیوفیلیزه
برای بازکردن آمپول لیوفیلیزه از الماس ضد عفونی شده با الکل استفاده می‌شود. در زیر هود میکروبی و در مجاورت شعله، آمپول را باز کرده و با استفاده از سرنگ استریل، مقداری محیط کشت مولر هینتون براث استریل شده را وارد آمپول کرده حدود 15 دقیقه زمان می‌دهیم تا اختلاط انجام شود. با استفاده از لوپ استریل، از این سوسپانسیون روی هرکدام از اسلنت‌های بسته شده حاوی محیط اسپورزایی کشت داده می‌شود.
به منظور تشکیل اسپور کافی در سطوح آگار، فانل‌ها به مدت 10 تا 14 روز در انکوباتور 30 درجه سانتی گراد قرار داده می‌شود(18).

3-4-2) آزمایش ها با محیط‌کشت صنعتی برای تولید اریتروماسین
تولید اریترومایسین با محیط‌کشت صنعتی دو مرحله اساسی دارد که شامل بذردهی و مرحله تخمیر است. در زیر هریک از این مراحل به همراه محیط‌های کشت مربوطه آورده شده است.

3-4-2-1) مرحله بذر‌دهی (Seeding)
دراین مراحل رشد باکتری به صورت میسلیومی است و هرگونه تشکیل اسپور برای تولید مضر است. در تهیه محیط‌کشت مرحله بذردهی نیز، کربنات کلسیم طبق روش ذکر شده در مرحله قبل آماده می‌شود. با توجه به میزان محیط لازم دراین مرحله، مقدار مواد را از جدول(3-3) محاسبه کرده در یک بشر ریخته و به مدت 10 دقیقه روی همزن – گرمکن مغناطیسی قرار می‌دهیم تا همه اجزاء محیط حل شده و یکنواخت گردند سپس محیط مدتی در درجه حرارت آزمایشگاه قرار داده می‌شود تا کمی سرد شود. در مرحله بعد PH آن سنجیده می‌شود.
pH=7/0 ± 0.1 محیط کشت قبل از استریلیزاسیون

جدول (3-3): ترکیبات محیط کشت بذردهی ( 18)
مقدار
ماده
g 40
Soy bean meal
g 5
Glucose
g 10
Glycerol
g 5/2
(NH4)2SO4
g 6/0
(NH2)HPO4
g 0/8
CaCO3
ml 1000
Distilled water

بعد از تهیه محیط کشت مرحله بذر‌دهی، تعدادی ارلن 1000 میلی‌لیتری آماده کرده و در هر کدام 100 میلی‌لیتر از محیط ساخته شده ریخته و برای استریل کردن آنها ار داخل اتوکلاو قرار می‌دهیم.
در مرحله بعد، به هر کدام از ارلن‌ها در کنار شعله و زیر هود بیولوژیک، به اندازه 1% حجم محیط داخل ارلن، سوسپانیون اسپوری اضافه کرده و در آنها را بالشتک پنبه‌ای قرار داده و برای مدت hr 44-40 در دمای ˚C30 با دور rpm 200 برای تکثیر باکتری و رشد میسلیومی در شیکرانکوباتور قرار می‌دهیم.
در انتهای این مرحله باید از بین ارلن‌ها بهترین ارلن را با توجه به معیارهای زیر انتخاب کرده و از آن برای مرحله بعد یعنی مرحله پیش تخمیر به عنوان مایه تلقیح استفاده می‌کنیم.

معیارهای انتخاب بهترین ارلن در مرحله بذردهی عبارتند از:
1-وزن تر بیومس تشکیل شده
2- شکل رشد
3-PH
4-از نظرآالودگی مشکلی نداشته باشد(18و12)

3-4-2-1-1)تعیین pH هر کدام از ارلن‌ها
مقدار pH را با استفاده از pH متر رومیزی می‌سنجیم. pH مناسب و ایده آل در این مرحله 1/6-9/5 است. اگر pH محیط بذردهی بیشتر از مقدار ذکر شده باشد باید ارلن ها را مجددأ در شیکر انکوباتور قرار دهیم تا در اثر رشد باکتری به pH مورد نظر برسند. در صورت کمتر بودن pH از حد مجاز، باید محیط کشت دور ریخته شود و آزمایش مجددأ تکرار شود(12).

3-4-2-1-2) تعیین وزن تر بیومس (PMW )
با توجه به این که یکی از معیارهای انتخاب ارلن بذردهی مناسب، نتایج حاصل از سنجش بیومس است، بنابراین باید این سنجش به سرعت و حداکثر طی یک ساعت انجام شود(3).
برای انجام این سنجش، از میکروتیوب های 1 میلی‌لیتری استفاده می‌کنیم. در ابتدا میکروتیوب خالی را وزن کرده و سپس ml1 از نمونه گرفته شده از محیط بذردهی را داخل میکروتیوب ریخته و دوباره وزن می‌کنیم. به این ترتیب وزن ml1 نمونه بدست می‌آید. میکروتیوب حاوی نمونه گرفته شده از محیط بذردهی را در سانتریفیوژ به مدت 20 دقیقه و با دور rpm400 قرار می‌دهیم تا بیومس تشکیل شده از مایع به صورت یک فاز جدا رسوب کند. در مرحله آخر فاز رویی که مایع است دور ریخته شده و میکروتیوب دوباره وزن می‌شود تا وزن رسوب بدست آید و با توجه به فرمول زیر درصد بیومس محاسبه می‌شود.
100× (وزن ا میلی لیتر نمونه/وزن رسوب) = درصد وزن

پایان نامه
Previous Entries تحقیق درباره کارشناسی ارشد، مورفولوژی، دانشگاه تهران، علوم پزشکی Next Entries تحقیق درباره نام گذاری