تحقیق درباره ميليليتر، دقيقه، استاندارد، ميزان

دانلود پایان نامه ارشد

غشاء سلولي
بعد از محاسبه درصد نشت يوني نسبي براي هر نمونه، درصد آسيب ديدگي غشاء سلولي در نمونههاي تحت تيمار شوري نسبت به نمونههاي شاهد از طريق رابطه زير محاسبه شد (2-7):
=درصد آسيب ديدگي1- [1- (T1/T2)/ 1- (C1/C2)] × 100 (2-7)
که در آن، (T1 و T2) به ترتيب هدايت الکتريکي اوليه و نهايي در نمونههاي تحت تيمار شوري و (C1 و C2)، به ترتيب هدايت الکتريکي اوليه و نهايي در نمونههاي شاهد است [Lutts et al., 1995].
2-6-7- فنل کل
2-6-7-1- استخراج از بافت برگ
براي استخراج عصاره برگ جهت اندازه‌گيري فنل کل و ظرفيت آنتياکسيداني از روش بخشي و آراکاوا [Bakhshi and Arakawa, 2006] استفاده شد. مقدار 1 گرم از نمونههاي برگ از برگهاي شاخه اصلي (برگهاي توسعه يافته از گرههاي 4 و 5) در پايان آزمايش، با استفاده از نيتروژن مايع در هاون چيني به پودر نرم تبديل شد. به پودر حاصل، 4 ميليليتر حلال استخراج، متشکل از 85% متانول و 15% استيک اسيد، اضافه شد. پس از مخلوط کردن، نمونهها براي انجام عمل استخراج به مدت 24 ساعت در يخچال با دماي 4 درجه سانتيگراد نگهداري شدند.
سپس بخش روشناور نمونه ها داخل ميکروتيوب ريخته شدند و با دور 10000 به مدت 10 دقيقه سانتريفيوژ (مدلEpendorf 5417 R )، شدند. بعد از سانتريفيوژ، بخش روشناور نمونهها جداسازي و در داخل ميکروتيوب ريخته شدند و جهت انجام آزمايشهاي مورد نظر در يخچال با دماي 20- درجه سانتيگراد نگهداري شدند [Bakhshi and Arakawa, 2006] .
2-6-7-2- تعيين ميزان فنل کل با روش اسپکتروفتومتري
ميزان فنلکل در عصارههاي برگ با روش Folin-Ciocalteu و با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، اندازهگيري شد. بدين منظور، ابتدا 1/0 گرم اسيدگاليک با متانول به حجم 100 ميليليتر رسانده شد، سپس محلول 10 درصد فولين (5 ميليليتر فولين با آبمقطر به حجم 50 رسانده شد) و کربنات سديم 5/7 درصد (5/7 گرم کربنات سديم در 100 سيسي آب حل شد) تهيه شد. محلول به دست آمده به مدت 5/1 ساعت در تاريکي و در دماي اتاق نگهداري شد و بعد از آن ميزان جذب با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 760 نانومتر اندازهگيري گرديد [Singleton et al., 1999].
براي تهيه محلولهاي استاندارد، مقدار 1/0 گرم گاليک اسيد با متانول خالص به حجم 100 ميليليتر رسانده شد. سپس از اين محلول استاندارد به ترتيب مقادير حجمي 5، 10، 20، 30، 40، 50، 60، 70، 80، 90، 100 و 120 ميکروليتر برداشته و داخل لوله آزمايش شيشهاي ريخته شد. به هر کدام از آنها مقدار 2500 ميکروليتر فولين رقيق شده با آب مقطر افزوده شد. پس از 10 تا 15 دقيقه، 2000 ميکروليتر کربنات سديم اضافه گرديد. ميزان جذب محلولهاي استاندارد پس از 5/1ساعت قرائت گرديد. سپس منحني استاندارد از روي الگوي جذب ترسيم شد. ميزان فنل كل از روي ميزان جذب نمونه و مقايسه آن با منحني استاندارد (شکل 2-1)، بر حسب ميليگرم گاليك اسيد در يک گرم ماده تر گياهي بيان شد.

شکل 2-1- منحني و معادله استاندارد فنل کل بر حسب گاليک اسيد
2-6-8- ظرفيت آنتياکسيداني کل
ظرفيت آنتياکسيداني عصارهها، از طريق خنثيکنندگي راديکال آزاد DPPH (2و2 ديفنيل1-پيکريل هيدرازيل) تعيين شد. براي اين منظور با استفاده از سمپلر، مقدار 50 ميکروليتر از عصارهها داخل لولههاي فالکون کوچک ريخته شد و 950 ميکروليتر محلول DPPH 1/0 ميلي نرمال به آنها اضافه شد. محلول حاصل به سرعت به هم زده شده و سپس به مدت 30 دقيقه در يک محفظه تاريک در دماي اتاق نگهداري شد. نمونه بلنک (صفر) و استاندارد به ترتيب شامل 1 ميليليتر حلال استخراج و 1 ميليليتر محلول 1/0 نرمال DPPH بود. سپس ميزان جذب استاندارد و نمونه با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، در طول موج 517 نانومتر تعيين شد. ظرفيت آنتياکسيداني عصارهها به صورت درصد بازدارندگي DPPH با استفاده از رابطه زير محاسبه شد (2-8)، [Singleton et al., 1999].
Antioxidant activity (DPPHSce%) = (Acont – Asamp)/Acont × 100 (2-8)
که در آن:
=%DPPHsc درصد بازدارندگي راديکال
DPPH Acont = ميزان جذب DPPH
Asamp= ميزان جذب (نمونه + DPPH)
2-7-ارزيابي صفات بيوشيميايي
2-7-1-کربوهيدراتهاي محلول
نمونههاي گياهي تهيه شده، به مدت 48 ساعت درون آون در دماي 75 درجه سانتيگراد خشک و بعد آسياب شدند و سپس با غربال مش شماره 8، الک شدند. 03/0 گرم از پودرهاي تهيه شده درون تيوبهاي 15 ميليليتري ريخته شدند. سپس10 ميليليتر اتانول80% کاملاً داغ به تيوبها اضافه و به مدت 30 ثانيه ورتکس شدند و به مدت 10 دقيقه با سرعت 3000 دور در دقيقه سانتريفيوژ شدند. بخش روشناور نمونهها به تيوبهاي 50 ميليليتري منتقل شدند و مراحل اضافه نمودن 10 ميليليتر اتانول 80% داغ به رسوب انتهايي، ورتکس، سانتريفيوژ و اضافه نمودن روشناور به تيوب 50 ميليليتر جديد ديگر، دوبار تکرار شد تا تمامي قندهاي محلول موجود در نمونه گياهي استخراج گردند. در مرحله بعد، تيوبها به مدت 24 ساعت درون آون با دماي 60 درجه سانتيگراد قرار داده شدند تا اتانول موجود در آنها کاملا تبخير گردد. پس از تبخير کامل اتانول، مقدار 40 ميليليتر آب مقطر به تيوبها اضافه و به مدت 2 دقيقه ورتکس شدند. به منظور حذف رسوبات اضافي و ديگر ترکيبات زائد، مقدار 5 ميليليتر سولفات روي 5% و 7/4 ميليليتر هيدروکسيد باريوم 3/0 نرمال به تيوبها اضافه و مجددا ورتکس شدند. سپس تيوبها با سرعت 3000 دور در دقيقه در دماي اتاق به مدت 10 دقيقه سانتريفيوژ شدند. همزمان 1 ميليليتر از روشناورها و 1 ميليليتر از محلولهاي استاندارد گلوکز (0، 10، 20، 40، 60، 80، 100 و 200 قسمت در ميليون) به تيوب 15 ميليليتر جديد انتقال داده شدند و به هريک از آنها 5/0 ميليليتر محلول فنل 5% اضافه و به شدت تکان داده شدند تا حبابهاي کف سفيد رنگ، داخل تيوبها نمايان شوند. مقدار 5/2 ميليليتر اسيد سولفوريک 98% بوسيله سرنگ (ديسپنسر42) به داخل تيوبها با فشار اضافه شد. پس از گذشت 45 دقيقه تا يک ساعت با تثبيت رنگ، توأم با خنک شدن تيوبها، ميزان جذب نمونهها در طول موج 485 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، اندازهگيري شد. در نهايت محتواي قندهاي محلول، از روي ميزان جذب نمونهها و مقايسه آن با منحني استاندارد (شکل 2-2)، و با توجه به رابطه زير (2-9)، بر حسب ميليگرم در گرم وزن خشک بيان شد [Kochert, 1987]
E=(C*D*V)/(DM*1000000)*1000 (2-9)
که در آن:
E : مقدار قند نمونه بر حسب ميليگرم در گرم وزن خشک
C : غلظت نمونه بر حسب ميليگرم در ليتر
D : درجه رقت
V : حجم نهايي عصاره تهيه شده
DM : وزن ماده خشک بر حسب گرم

شکل 2-2- منحني و معادله استاندارد گلوکز

2-7-2-کربوهيدراتهاي نامحلول
نمونههاي گياهي تهيه شده، به مدت 48 ساعت درون آون در دماي 75 درجه سانتيگراد خشک و بعد آسياب شدند و سپس با غربال مش شماره 8، الک شدند. 03/0 گرم از پودرهاي تهيه شده درون تيوبهاي 15 ميليليتري ريخته شدند. سپس10 ميليليتر اتانول80% کاملاً داغ به تيوبها اضافه و به مدت 30 ثانيه ورتکس شدند و به مدت 10 دقيقه با سرعت 3000 دور در دقيقه سانتريفيوژ شدند. بخش روشناور نمونهها به تيوبهاي 50 ميليليتري منتقل شدند و مراحل اضافه نمودن 10 ميليليتر اتانول 80% داغ به رسوب انتهايي، ورتکس، سانتريفيوژ و اضافه نمودن روشناور به تيوب 50 ميليليتر جديد ديگر، دوبار تکرار شد تا تمامي قندهاي محلول موجود در نمونه گياهي استخراج گردند. تفالههاي حاصل بعد از عمل شست و شو با اتانول جمع آوري و به مدت 2 ساعت درون دستگاه آون در دماي 50 درجه سانتيگراد خشک شدند. 5/4 ميليليتر آب مقطر و 6 ميليليتر پرکلريک اسيد 52% به نمونهها اضافه شدند و به مدت 24 ساعت درون يخچال در دماي 4 درجه سانتيگراد قرار داده شدند. سپس، بمنظور جداسازي فاز رويي محلول، نمونهها در 3000 دور در دقيقه به مدت 10 دقيقه سانتريفيوژ شدند. روشناورهاي به دست آمده، درون فالکون 50 ميليليتري جديد ريخته شدند و 30 ميليليتر آب مقطر به آنها اضافه شد.
همزمان 1 ميليليتر از روشناورها و 1 ميليليتر از محلولهاي استاندارد گلوکز (0، 10، 20، 40، 60، 80، 100 و 200 قسمت در ميليون) به تيوب 15 ميليليتر جديد انتقال داده شدند و به هريک از آنها 5/0 ميليليتر محلول فنل 5% اضافه شد و به شدت تکان داده شدند تا حبابهاي کف سفيد داخل تيوبها نمايان شوند. مقدار 5/2 ميليليتر اسيد سولفوريک 98% بوسيله سرنگ (ديسپنسر) به داخل تيوبها با فشار اضافه شد. پس از گذشت 45 دقيقه تا يک ساعت با تثبيت رنگ، توأم با خنک شدن تيوبها، ميزان جذب نمونهها در طول موج 485 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، اندازهگيري شد. در نهايت محتواي قندهاي نامحلول، از روي ميزان جذب نمونهها و مقايسه آن با منحني استاندارد (شکل 2-2)، و با توجه به رابطه زير (2-10)، بر حسب بر حسب ميليگرم در گرم وزن خشک بيان شد [Kochert, 1987]
E=(C*D*V)/(DM*1000000)*1000 (2-10)
که در آن:
E : مقدار قند نمونه بر حسب ميليگرم در گرم وزن خشک
C : غلظت نمونه بر حسب ميليگرم در ليتر
D : درجه رقت
V : حجم نهايي عصاره تهيه شده
DM : وزن ماده خشک بر حسب گرم
2-7-3-پرولين
5/0 گرم ماده تر گياهي از برگهاي شاخه اصلي (برگهاي توسعه يافته از گرههاي 4 و 5) در پايان آزمايش با هاون له و درون تيوبهاي 15 ميليليتري ريخته شدند. سپس 10 ميليليتر اسيد سولفوساليسيليک 3 درصد به آنها اضافه شد و به مدت 10 دقيقه درون حمام آب يخ قرار داده شدند. تيوب‌ها با سرعت 15000 دور در دقيقه به مدت 10 دقيقه در دماي 4 درجه سانتي گراد سانتريفيوژ شدند تا مواد اضافي از محلول جدا شوند. 2 ميليليتر از روشناور حاصل از سانتريفيوژ، درون تيوبهاي 15 ميليليتري جديد ريخته شدند و 2 ميليليتر اسيد نينهيدرين و 2 ميليليتر اسيد استيک خالص به آن افزوده و سپس خوب مخلوط شدند. همزمان مقدار 2 ميليليتر از استانداردهاي 0، 4، 8، 12، 16 و 20 ميليگرم در ليتر پرولين درون تيوبهاي جديد ريخته و 2 ميليليتر اسيد نينهيدرين و 2 ميليليتر اسيد استيک گلاسيال به آن افزوده و سپس خوب مخلوط شدند. نمونههاي اصلي و استاندارد ابتدا به مدت يک ساعت درون حمام آب گرم در دماي 100 درجه سانتي گراد و سپس به مدت 10 دقيقه درون حمام آب يخ قرار داده شدند تا کاملاً سرد شده و واکنش متوقف شود. سپس 4 ميليليتر تولوئن به محلول اضافه شد و به مدت 20 ثانيه با دستگاه ورتکس هم زده شدند. ميزان جذب نمونهها در طول موج 528 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، اندازهگيري شدند. در نهايت محتواي پرولين، از روي ميزان جذب نمونهها و مقايسه آن با منحني استاندارد و با توجه به رابطه (2-11)، بر حسب ميکرومول در گرم نمونه تر گياهي بيان شد [Bates et al., 1973].
Proline (umol/gFw)=([(µg Proline/ml×ml Toluene)/(115.5µg/(µmole))])/((g sample/5)) (2-11)
شکل 2-3- منحني و معادله استاندارد پرولين

2-7-4- پراکسيداسيون ليپيدها
براي سنجش مقدار پراكسيداسيون ليپيدهاي غشاء، غلظت مالونديآلدئيد و ساير آلدئيدها كه محصولات اكسيداسيون اسيدهاي چرب غيراشباع هستند، اندازهگيري شد.
2-7-4-1- مالون ديآلدئيد (MDA)
2/0 گرم از بافت تازه برگي از برگهاي شاخه اصلي (برگهاي توسعه يافته از گرههاي 4 و 5) در پايان آزمايش در هاون چيني حاوي 5 ميليليتر تريكلرواستيك اسيد 1/0 درصد سائيده شد. عصاره حاصل با استفاده از دستگاه سانتريفوژ به مدت 5 دقيقه در 10000 دور در دقيقه سانتريفوژ شد. به يك ميليليتر از محلول رويي حاصل از سانتريفوژ، 5 ميليليتر محلول تريكلرواستيك اسيد

پایان نامه
Previous Entries تحقیق درباره برگهاي، تيمار، اندازهگيري، گيري Next Entries تحقیق درباره دقيقه، ميليليتر، ميلي، اسيد