می‌شود در اینجا نیز pH تا روز هشتم روند افزایشی داشته و سپس کاهش می‌یابد یعنی مقدار آن در روز چهارم 7/4 بوده در روز هشتم به 4/8 می رسد سپس مقدار آن کم شده و به 9/7 در روز یازدهم می‌رسد.
4-2-4-1-3 ) بررسی اثر غلظت بهینه (40% اوره) بر روی درصد وزن تر بیومس
نمودار (4-9)، درصد وزن تر بیومس را در طی فرایند تخمیر در غلظت 40% اوره نشان می‌دهد.
نمودار(4-9): درصد وزن تر بیومس در طی فرایند تخمیر در غلظت 40% اوره
4-2-4-1-4 ) بررسی اثر غلظت بهینه (40% اوره) بر روی مورفولوژی باکتری
تأثیر استفاده از اوره بر روی مورفولوژی سویه مولد مشابه تأثیر استفاده از سویا در محیط شاهد است.
در ادامه به بررسی مورفولوژی Saccharopolyspora erythraea در حضور غلظت بهینه 40% اوره در طی فرایند تخمیر می‌پردازیم.
شکل( 4-6 ) مورفولوژی میسلیوم‌ها را در روز چهارم تخمیر نشان می‌دهد.
شکل(4-6): مورفولوژی میسلوم های Saccharopolyspora erythraea در روز چهارم تخمیردر غلظت 40% اوره
شکل( 4-7 ) مورفولوژی میسلیوم‌ها را در روز ششم تخمیر نشان می‌دهد.
شکل(4-7): مورفولوژی میسلوم های Saccharopolyspora erythraea در روز ششم تخمیردر غلظت 40% اوره
شکل( 4-8 ) مورفولوژی میسلیوم‌ها را در روز هشتم تخمیر نشان می‌دهد.
شکل(4-8): مورفولوژی میسلیوم های Saccharopolyspora erythraea در روز هشتم تخمیردر غلظت 40% اوره
شکل( 4-9 ) مورفولوژی میسلیوم‌ها را در روز دهم تخمیر نشان می‌دهد.
شکل(4-9): مورفولوژی میسلوم های Saccharopolyspora erythraea در روز دهم تخمیردر غلظت 40% اوره
شکل( 4-10 ) مورفولوژی میسلیوم‌ها را در روز یازدهم تخمیر نشان می‌دهد.
شکل(4-10): مورفولوژی میسلوم های Saccharopolyspora erythraea در روز یازدهم تخمیردر غلظت 40% اوره
فصل پنجم
تاثیر ترکیبات به کار رفته در محیط کشت تخمیر در تولید آنتی‌بیوتیک‌ها
مرحله نهایی تخمیر، کانون عمده هزینه عملیات تولید کردن آنتی بیوتیک است. امروزه در تخمیر صنعتی، کاهش قیمت انرژی عامل مهم و اساسی می‌باشد. طراحی محیط کشت با هدف رشد اولیه سریع، آسان‌تر از طراحی محیط کشت برای مرحله بعدی، یعنی بیشترین تولید محصول است. این مسأله به خصوص در مورد متابولیت‌های ثانویه وجود دارد. میکروارگانیسم‌ها در وضعیتی قادر به تولید چنین محصولاتی هستند که شدت رشد ویژه از مقدار معینی کمتر باشد. بنا‌بر‌این، نکته کلیدی در تولید متابولیت‌های ثانویه، طراحی نوعی محیط کشت برای مرحله نهایی است که پس از مرحله رشد اولیه سریع، کمبود یک یا چند ماده مغذی در آن به‌وجود آید. پس بین مواد تشکیل دهنده محیط کشت و تولید اریترومایسین ارتباط زیادی وجود دارد که در بین این مواد، منبع نیتروژنی یکی از منابع حائز اهمیت است. استفاده از منابع اولیه که از نظر قیمت، ارزان و از نظر کیفیت مناسب بوده و در طول تمام فصول سال به آسانی در دسترس باشد برای تهیه محیط کشت حائز اهمیت است که باعث کاهش هزینه‌های تولید و در نتیجه صرفه‌جویی اقتصادی خواهد شد. در ادامه به بحث در مورد این موضوع می‌پردازیم.
5-1) رابطه بین منابع نیتروژنی استفاده شده در محیط کشت تخمیر و تولید اریترومایسین
نیتروژن 8 تا 14 درصد از وزن خشک باکتری‌ها و قارچ‌ها را تشکیل می‌دهد. می‌توان طیف وسیعی از ترکیبات آلی و معدنی را برای تامین نیاز میکروارگانیسم‌ها به نیتروژن به کار برد. به دلیل اهمیت منبع نیتروژنی در محیط کشت و تولید آنتی‌بیوتیک، در ابتدا به بیان نتایج برخی از تحقیقات صورت گرفته در این زمینه می‌پردازیم سپس نتایج بدست آمده از این پژوهش را مورد بررسی قرار می‌دهیم.
1-پایان نامه دکتری تحت عنوان بررسی اثر منابع کربن و نیتروژن محیط پیش‌کشت در رشد و تولید اریترومایسین که در سال 1384 توسط مهسا رستم زا به راهنمایی اشرف السادات نوحی، جواد حامدی و همکاران در دانشکده علوم دانشگاه آزاد واحد علوم و تحقیقات انجام شد. در این پژوهش اثر منابع کربنی شامل نشاسته، دکسترین، گلوکز، گلیسرول، ملاس چغندرقند و منابع نیتروژنی بومی شامل آرد سویا، شیرابه ذرت، نیترات آمونیوم و سولفات آمونیوم در محیط کشت بذردهی و تولید اریترومایسین بررسی شد. نتایج حاصله بدین صورت بوده است که میزان تولید اریترومایسین در محیط‌های بذردهی حاوی غلظت‌های 15-0 گرم در لیتر دکسترین، 5-0 گرم در لیتر نشاسته، 15-0 گرم در لیتر ملاس چغندرقند و 20-0 گرم در لیتر گلیسرول با محیط شاهد یکسان بوده است.
همچنینن میزان تولید اریترومایسین از تلقیح محیط‌های بذردهی حاوی غلظت‌های 20-10 گرم در لیتر گلیسرول بیشتر از 15-5 گرم در لیتر دکسترین و نشاسته است. مناسب‌ترین غلظت منابع کربنی و نیتروژنی در محیط‌های بذردهی به ترتیب 10 گرم در لیتر گلیسرول و 40 گرم در لیتر آرد سویا بوده است. ( رستم زا ، 1383)
2-پایان نامه کارشناسی ارشد تحت عنوان بررسی آرد سویا و آرد کلزا در تولید اریترومایسین توسط باکتری Saccharopolyspora erythraea که در سال 1387 توسط غزل لبیکی به راهنمایی حسین عطار و جواد حامدی در دانشکده فنی و مهندسی دانشگاه آزاد واحد علوم و تحقیقات انجام شد.
در این پژوهش اثر غلظت‌های مختلف آرد سویا و آرد کلزا در رشد باکتری Saccharopolyspora erythraea و تولید اریترومایسین بررسی گردید. نتایج حاصله بدین صورت بوده است که میزان تولید اریترومایسین در محیط‌های حاوی آرد کلزا با غلظت 50،40،30،20،10 گرم در لیتر به ترتیب 1،23،0،7،1،28،1،49،2،47،2،09 برابر میزان اریترومایسین تولید شده در محیط حاوی آرد سویا بوده است. همچنین در بین تمامی محیط‌های کشت تخمیر، غلظت بهینه برای آرد سویا 30 گرم در لیتر بوده است.(لبیکی ، 1387)
5-1-1)مقایسه اثر غلظت‌های مختلف اوره و سویا به عنوان منبع نیتروژنی بر تولید اریترومایسین
همانطور که گفته شد چندین فاکتور برای رشد بهینه میکروارگانیسم‌ها مطرح است که عبارتند از: منبع انرژی، مواد غذایی مورد نیاز، شرایط فیزیکی و شیمیایی و مایه تلقیح مناسب که در این میان 3 عامل اول تا حد زیادی به طراحی و تهیه محیط کشت وابسته است. یکی از ترکیبات مهم محیط کشت، منبع نیتروژنی است وآرد سویا یکی از منابع نیتروژنی شناخته شده برای تولید اریترومایسین است که اوره در این پژوهش با غلظت های مختلف جایگزین آن شده است.
در راستای اهداف این پروژه، سوالاتی مطرح شد که که در ادامه به آنها می‌پردازیم.
الف) آیا افزودن غلظت‌های مختلف اوره در محیط کشت تخمیر باکتری Saccharopolyspora erythraea اثری بر تولید اریترومایسین دارد؟
همانطور که در نمودار (4-6) نیز مشاهده شد نتایج بدست آمده از این پژوهش نشان داد که غلظت‌های مختلف اوره به عنوان منبع نیتروژن، باعث تولید مقادیر مختلف اریترومایسین شده است. همچنین تغییر غلظت‌ها بر روی مدت زمان فرایند تخمیر نیز تاثیرگذار بوده است که منجر به این شده که در روزهای متفاوتی شاهد بیشترین مقدار تولید اریترومایسین باشیم.
برای مثال در غلظت اوره 70 % و 100% حداکثر میزان تولید اریترومایسین را در روز دهم داشتیم و در باقی غلظت‌ها حداکثر تولید در روز هشتم مشاهده شد.
ب) بهترین غلظت اوره در محیط کشت تخمیر باکتری Saccharopolyspora erythraea برای دستیابی به بیشترین مقدار تولید آنتی‌بیوتیک ، چه مقدار بوده است؟
با توجه به نتایج بدست آمده در بخش (4-2-4 )، مشخص شد که غلظت بهینه برای استفاده از اوره شامل 40% اوره و 60 % سویا ( 12گرم اوره و 18 گرم سویا ) به عنوان منبع نیتروژنی می‌باشد یعنی به ازای این مقدار اوره و سویا، بیشترین میزان اریترومایسین تولید می‌شود که در این غلظت، حداکثر مقدار تولید آن 05/118 میلی گرم در لیتر بوده است.
5-2) رابطه بین منبع نیتروژنی استفاده شده و pH محیط کشت تخمیر
یکی از پارامترهای مهم در فرایند فرمانتاسیون، pH است. این پارامتر بر روی سرعت رشد سلول‌ها ، قابلیت زنده ماندن و تولید محصول تاثیر می‌گذارد.
تحقیقات نشان داده‌اند که میکروارگانیسم‌های مختلف دامنه pH متفاوتی برای رشد مناسب دارند. همینطور مشخص شده است که میکروارگانیسم‌های باکتریایی که قادر به تولید آنتی‌بیوتیک هستند معمولا در محیط‌هایی با pH خنثی پرورش می‌یابند.(قجاوند،1382)
در این پژوهش، پس از ساخت محیط تخمیر، pH بر روی 8/6 تنظیم شد که pH مناسب برای شروع فرایند تخمیر است. در طی این فرایند شاهد تغییرات pH بودیم. همانطور که در شکل (4-11) مشاهده شد، در غلظت‌های 100% و 70% اوره، ما شاهد افزایش pH در روز چهارم بودیم و در روز ششم، حداکثر میزان pH مشاهده شد. سپس مقدار آن کاهش یافته و در روز یازدهم به کمترین مقدار خود رسید.
دلیل این امر این است که pH اوره قلیایی است. در نتیجه با وجودیکه ابتدا pH محیط تخمیر را روی 8/6 تنظیم می کنیم، در روزهای اول شاهد افزایش pH خواهیم بود. از آنجا که غلظت های 100% و 70% اوره، حاوی بیشترین مقدار اوره هستند در نتیجه باعث می‌شوند که دوره تطبیق باکتری با محیط طولانی شود. به همین دلیل در این غلظت‌ها، مدت زمان فرایند تخمیر افزایش یافته است. پس تنها مشکل در سازگاری، بالا بودن pH محیط است.
در باقی غلظت‌ها، pH از روز چهارم روند افزایشی داشته و این مقدار در روز هشتم به حداکثر مقدار خود رسید که بیشترین مقدار تولید اریترومایسین نیز در همین روز مشاهده شد. دلیل این حالت این است که در ابتدای فرایند تخمیر، ظاهرا به دلیل وجود متابولیت های اسیدی حاصل از تجزیه کربوهیدرات‌ها pH کاهش می‌یابد. سپس به دلیل تولید ترکیبات قلیایی که احتمالا حاصل تجمع متابولیت‌های حاصل از مصرف سویا و آمونیوم و اوره است، pH بتدریج افزایش می‌یابد.
یکی دیگر از دلایل افزایش pH را می‌توان به تولید اریترومایسین در محیط نسبت داد که خود ماهیت قلیایی دارد (1969, Herrel )
5-3) رابطه بین رشد باکتری Saccharopolyspora erythraea و میزان تولید اریترومایسین
مطالعات و پژوهش‌های زیادی در این باره انجام شده و نظرات متفاوتی ارائه شده است از جمله نظریه کلاسیک که بیان می‌کند حداکثر شدت تولید متابولیسم ثانویه‌ای نظیر اریترومایسین بعد از حداکثر شدت رشد باکتری و در زمان توقف رشد سویه مولد می‌باشد؛ با این حال این موضوع در همه موارد آشکار نمی‌باشد و به ویژه تمایز بین فاز رشد یا تروفوفاز و فاز تولید یا ایدیوفاز در کشت‌های برخی از میکروارگانیسم‌های رشته‌ای و قارچ‌ها به خوبی مشاهد نشده است(1995،Betina)
به طور کلی می‌توان گفت هم‌زمان بودن یا نبودن رشد باکتری و تولید اریترومایسین به شرایط تخمیر به ویژه ترکیبات محیط کشت و مقدار استفاده شده از آنها بستگی دارد (1967، BU’LOCK).
در این رابطه تحقیقاتی صورت گرفته که در ادامه به بیان برخی از آنها و سپس به توضیح و تحلیل مشاهدات حاصل از این پژوهش خواهیم پرداخت :
*مک درموت و همکاران (1993) در انگلستان به انجام مطالعه در زمینه تولید اریترومایسین توسط باکتری Saccharopolyspora erythraea پرداختند و نشان دادند در محیط‌هایی که محدودیت نیترات برای سویه باکتری وجود دارد، رشد باکتری مولد و میزان اریترومایسین تولیدی با یکدیگر همراه بوده اند در حالی که محدودیت در میزان منابع کربنی هم‌زمان با محدودیت فسفات در محیط سبب مستقل بودن تولید اریترومایسین از رشد سویه مولد آن می‌شود. همچنین وجود محدودیت در منابع نیتروژنی محیط نیز سبب تشکیل محصول وابسته به رشد می‌شود.
*خضروی در پژوهشی نشان داد که سولفات آمونیوم یکی از منابع نیتروژنی است که در صورت استفاده از آن، تولید اریترومایسین وابسته به رشد بوده اما در صورت استفاده از منبع نیترات آمونیوم، تولید مستقل از رشد می‌گردد.( 18)
*تریلی و همکاران (1987) نشان دادند که تولید اریترومایسین و رشد باکتری S. erythraea در محیط فسفات محدود، همراهی زیادی داشته؛ ولی این پژوهشگران این وضعیت را یک استثنا در نظر گرفته و آن را به ویژگی‌های سویه و جهش احتمالی نسبت
