تحقیق درباره مورفولوژی، مواد غذایی، فیزیولوژی، مصرف مواد

داده‌اند(1987, Trilli)
*حامدی(1381) هم‌زمان بودن یا عدم هم‌زمانی میزان رشد و تولید اریترومایسین را قویا تحت تاثیر ترکیبات محیط کشت ارزیابی کرده و در این زمینه نشان داده است که در محیط‌های کشت حاوی روغن سویا، گلرنگ و پنبه دانه هم‌زمانی بین رشد سویه و تولید اریترومایسین وجود دارد در حالی که در محیط‌های کشت حاوی روغن گردو، ذرت و زیتون رشد باکتری و تولید اریترومایسین مستقل از یکدیگرند(3).
*خضروی نشان داد که افزودن پروپانول و پروپیونیک اسید به محیط کشت تخمیر باکتری S. erythraea سبب مستقل شدن رشد باکتری مولد و میزان تولید اریترومایسین از هم شده است(18)
دراین پژوهش، از مشاهده نحوه رشد باکتری Saccharopolyspora erythraea در زیر میکروسکوپ، مشخص شد که میزان رشد باکتری علاوه بر ترکیبات مورد استفاده در محیط کشت به میزان مورد استفاده از هر ترکیب نیز وابسته است. همانطور که در شکل (4-13) مشاهده شد در غلظت های 30%، 40%، 50% و 60% اوره رشد باکتری در محیط تخمیر تا اواسط دوره یعنی روز هشتم ادامه داشته که همزمان با آن شاهد تولید اریترومایسین نیز بودیم. در غلظت های 70% و 100% اوره این رشد تا روز دهم نیز مشاهده شده است.
بر اساس نتایج بدست آمده در هر حالت می‌توان اظهار داشت که هم زمان با رشد Saccharopolyspora erythraea در محیط کشت تخمیر، تولید اریترومایسین نیز وجود داشته اما پس از توقف رشد سویه، تولید اریترومایسین متوقف نشده تا نهایتا به بیشترین میزان تولیدی خود رسیده است.

5-4 ) رابطه بین رشد میزان باکتری Saccharopolyspora erythraea و تغییرات بیومس در طی فرایند تخمیر
از آنجا که رشد میکروبی و مراحل مختلف آن سبب ایجاد تغییرات در درصد بیومس تولیدی می‌شوند، به منظور داشتن بیان واضحتری از این ارتباط، به بیان توضیح مختصری درباره سینتیک رشد می‌پردازیم.

5-4-1) سینتیک رشد میکروارگانیسم ها
ابتدا محلول غذایی استریل با میکروارگانیسم ها تلقیح شده و تحت شرایط فیزیولوژیکی اپتیمم انکوباسیون انجام می‌شود. در ضمن عمل تخمیر، هیچ چیز به جز اکسیژن (به صورت هوا)، عامل ضد کف و اسید یا باز برای کنترل pH، اضافه نمی‌شود. بنابراین در نتیجه متابولیسم سلولها، معمولا ترکیب شیمیایی محیط کشت، غلظت بیومس و غلظت متابولیت دائما تغییر می‌کند. بعد از تلقیح محلول غذایی استریل با میکروارگانیسم‌ها و کشت در شرایط فیزیولوژی اپتیمم، چهار فاز مشخص رشد مشاهده می‌شوند: فاز تأخیر، فاز لگاریتمی، فاز سکون و فاز مرگ.
فاز تأخیر: هنگامی که سلولها از یک محیط به محیط دیگر منتقل می‌شوند، در ابتدا هیچ افزایشی در تعداد سلولها صورت نمی‌گیرد هرچند که ممکن است وزن سلول تغییر کند. در این مرحله میکروارگانیسم‌ها با محیط جدید خود سازش پیدا می‌کنند. مقدار مایه تلقیح و شرایط فیزیولوژیکی آن بر زمان مرحله تأخیر اثر می‌گذارد. اگر حجم مایه تلقیح تا حد ممکن زیاد باشد از طولانی شدن این مرحله جلوگیری و توانایی محصول‌دهی را افزایش می‌دهد. از نظر شرایط فیزیکی نیز تا حد ممکن محیط کشت مایه تلقیح و محیط کشت تخمیر باید از نظر pH و ترکیب دو محیط حتی‌الامکان از یک نوع باشند. به نظر می‌رسد مهمترین فاکتور تأثیرگذار در این خصوص فعال بودن مایه تلقیح باشد. اگر کشت میکروبی که به عنوان مایه تلقیح استفاده می‌شود هنوز در فاز لگاریتمی باشد ممکن است فاز تأخیر روی ندهد و بلافاصله فاز رشد شروع شود. اما اگر مایه تلقیح از کشتی گرفته شود که رشد آن به علت محدود شدن مقدار سوبسترا متوقف گردیده باشد، به زمان بیشتری برای سازش با محلول غذایی جدید نیاز خواهد داشت(17).
لینکن (1960) معتقد است که باید بین مقادیر آنیون‌های موجود تفاوت کمی باشد، در غیر این صورت موجب تغییرات ناگهانی سرعت مصرف مواد اولیه شده و این امرمتعاقبا بر قابلیت حیات میکروارگانیسم هم اثر خواهد گذاشت و در نهایت باعث طولانی شدن زمان تأخیر می‌شود. همچنین غلظت مایه تلقیح بر روی فاز تأخیر نیز تأثیر می‌گذارد. کشت و انتقال صحیح مایه تلقیح برای تولید بعدی متابولیت‌های اولیه و ثانویه ضروری است.
فاز لگاریتمی: پس از گذشت مرحله تأخیر، سرعت رشد میکروبی به تدریج افزایش می‌یابد تا این که به حداکثر مقدار خود می‌رسد؛ این مرحله به نام مرحله لگاریتمی رشد نامیده می‌شود. در طول این مرحله، محصولات تولید شده برای رشد سلول‌ها ضروری بوده و شامل اسیدهای آمینه، نوکلئوتیدها، پروتئین‌ها، اسیدهای نوکلئیک، لیپیدها، کربوهیدرات ها و غیره است که به عنوان محصولات اولیه متابولیسم شناخته می‌شود.
فاز سکون: در طول مراحل کاهش سرعت و سکون، یعنی هنگامی که به مرحله رکود رسید و رشد متوقف شد، شروع به تولید متابولیسم ثانویه می‌کند. محصولاتی مانند آنتی‌بیوتیک‌ها و ویتامین‌ها در انتهای مرحله لگاریتمی و در فاز سکون تولید می‌شوند. چنین متابولیت‌های ثانویه‌ای محصولات مستقل از رشد نامیده می‌شوند و سینتیک آنها به سرعت رشد سلولها بستگی ندارد. باید توجه داشت که واژه متابولیت ثانویه بدین معنا نیست که محصول در مرحله رشد تشکیل نشده است بلکه تشکیل محصول برای رشد میکروارگانیسم ضروری نیست( 9).
فاز مرگ: در این فاز ذخائر انرژی سلولها کاملا مصرف می‌شوند. فاصله زمانی بین فاز سکون و مرگ، به نوع میکروارگانیسم و فرایند مورد استفاده بستگی دارد. معمولا در فرایندهای صنعتی، تخمیر را در انتهای فاز لگاریتمی یا قبل از شروع فاز مرگ قطع می‌کنند(17).

نوع میکروارگانیسم و ترکیبات محیط‌کشت در تمام این مراحل نقش مؤثر و بسزایی ایفا می‌کنند.
میزان رشد و مورفولوژی باکتری بر روی درصد بیومس تولیدی کاملا تأثیرگذار است و در 4 فاز ذکر شده، شاهد درصدهای بیومس متفاوتی می‌باشیم.
در روزهای نخست، باکتری در فاز تأخیر است که در این حالت سلول‌ها در حال تطابق با محیط جدید خود هستند. به همین دلیل باکتری به صورت قطعات خیلی کوتاه و غیر منسجم می‌باشد و در این حالت درصد بیومس پایین است.
سپس وارد فاز لگاریتمی می‌شوند یعنی سلول‌ها با شرایط جدید سازگاری پیدا کرده‌اند و در حال رشد سریع می‌باشند. از این رو میسلیوم‌ها طویل شده و انشعابات و شاخه‌های زیادی پیدا می‌کنند در نتیجه میزان بیومس افزایش پیدا می‌کند.( بسته به میزان و نوع ترکیبات به کار رفته در محیط، در روزهای چهارم تا ششم شاهد این تغییرات بودیم)
در ادامه وارد فاز سکون می‌شویم که در این مرحله به دلیل متابولیزه شدن سوبستراها یا تشکیل مواد سمی، رشد شروع به کند شدن یا متوقف شدن می‌کند و در این حالت بیومس معمولا ثابت باقی می‌ماند.( بسته به میزان و نوع ترکیبات به کار رفته در محیط، در روزهای ششم تا دهم شاهد این تغییرات بودیم)
سپس فرایند تمام شده و وارد فاز مرگ می‌شویم که در این حالت ذخائر انرژی سلول‌ها کاملا مصرف می‌شود و سلول‌ها با سرعت نمایی می‌میرند. پس شاهد تجزیه میسلیوم‌ها و کاهش درصد بیومس خواهیم بود.( روزهای دهم تا دوازدهم)
در این پژوهش، میزان تغییرات بیومس کاملا با نحوه میزان رشد باکتری Saccharopolyspora erythraea مطابقت دارد.
در ابتدای مرحله تخمیر که باکتری در فاز تأخیری است و رشدی صورت نگرفته است، میزان درصد وزن تر بیومس تولید شده بسیار ناچیز است. با ورود به فاز لگاریتمی که مرحله شروع رشد و افزایش آن، میزان درصد وزن تر بیومس نیز افزایش داشته و تا زمان کامل شدن رشد باکتری به حداکثر مقدار خود رسیده است.سپس وارد فاز سکون و پس از آن فاز مرگ می‌شود که کاهش درصد وزن تر بیومس را شاهد بودیم که این مراحل، مطالب عنوان شده در این بخش را تأیید می‌نماید.

5-5) رابطه بین مورفولوژی سویه Saccharopolyspora erythraea و تولید اریترومایسین
باکتری Saccharopolyspora erythraea یک میکروارگانیسم رشته ای است که در دسته اکتینومیست‌ها قرار دارد. این باکتری‌ها رشد پیچیده‌ای نسبت به سایر میکروارگانیسم‌ها دارند. رشد اکتینومایست‌ها بواسطه دراز شدگی متقارن ( دراز شدن بواسطه توسعه سرکهای هیفی ) است (Locci,1979) .این پروسه را می‌توان در جوانه زدن اسپوری و در طول رشد مجدد قطعه‌های هیفی مشاهده کرد. رشد نوکی (توسعه سرکهای هیف ) استرپتومایست‌ها را اولین بار Gottlieb (1953) گزارش کرد. مطالعات اتورادیوگرافیک با Streptomyces antibioyicus نیز رشد ترجیحی دیواره سلول در ناحیه نوک هیف را تأیید می‌کند (Brana و همکاران 1982 ).
جوانه به واسطه توسعه هیفی و شاخه‌دار شدن به شکل میسلیوم یعنی شبکه‌های هیف تغییر شکل پیدا می‌کند. این رشته‌ها به هم اتصال پیدا می‌کنند و در این حالت، ساختاری به وجود می‌آید که منجر به افزایش ویسکوزیته مایع تخمیر می‌گردد(12).
از آنجا که رابطه مستقیمی بین مورفولوژی سویه مولد و تولید اریترومایسین وجود دارد، تحقیقات و مطالعاتی در این زمینه انجام شده است که در ادامه به بیان برخی از آنها و در نهایت به توضیح مشاهدات انجام شده در همین زمینه، در این پژوهش می‌پردازیم.
*طبق مطالعات صورت گرفته مشخص شده است که برای اینکه سویه‌های مولد، قادر به تولید آنتی‌بیوتیک باشند باید دارای حداقل اندازه µm 88 بوده و تنها تحت این شرایط است که علاوه بر رشد، آنتی‌بیوتیک نیز ترشح می‌شود.(12)
*رادل و همکاران(1999) بیان کردند که برای تولید آنتی‌بیوتیک توسط هیف‌های سویه مولد، باید در نوک هیف جایگاه ترشح آنتی‌بیوتیک وجود داشته باشد و در ضمن طول هیف باید از فاصله بین جایگاه ترشح تا نوک هیف بلندتر باشد و در این شرایط است که تولید آنتی‌بیوتیک را خواهیم داشت و در ضمن، ایجاد محدودیت مواد غذایی در محیط کشت سبب ایجاد مناطق غیر زنده ای در هیف میسلیوم می‌شود( wardell, 1999 )
*Whitakar (1992) به مطالعه بر روی غلظت مایه تلقیح بر مورفولوژی پرداخت و نشان داد که شکل مورفولوژی تعدادی از اکتینومیست‌ها به وسیله غلظت‌های اسپوری زنده در مایه تلقیح تحت تأثیر قرار می‌گیرد و غلظت‌های بالا در این حالت به تولید شکل پراکنده میسلیوم‌ها و غلظت‌های پایین مایه تلقیح معمولا به شکل پلت منجر می‌شود. در همین راستا Trenser با انجام مطالعات بیشتر به این نتیجه دست یافت که افزایش بیش از حد مایه تلقیح، باعث افزایش درجه خرد شدگی میسلیوم‌ها می‌گردد(12).
*حامدی (1381) مطالعاتی روی تأثیر ترکیبات محیط کشت بر روی مورفولوژی باکتری‌ها انجام داد و به این نتیجه رسید که در محیط‌های حاوی روغن کوسه ماهی و اسیدهای چرب، هیف‌ها زودتر از حالت منشعب خارج شده و قطعه قطعه می‌شوند اما در محیط حاوی روغن سویا، کلزا، پنبه دانه و آفتابگردان، هیف‌ها به مدت طولانی‌تری به حالت منشعب باقی می‌مانند.
*در همین راستا قجاوند(1382) نشان داد ترکیبات مختلف محیط کشت بر روی مورفولوژی میسلیوم‌ها و در نتیجه در میزان تولید اریترومایسین تأثیرات بسیار متفاوتی دارند و آنچه واضح است این است که رشد میسلیومی پراکنده در محیط‌های کشت غنی (پیچیده) بیشتر است.
در این پژوهش، در تمامی حالات مورد مطالعه میزان شکل و رشد هیف‌ها و میزان تولید اریترومایسین، رابطه مستقیمی با یکدیگر داشتند. هیف‌ها در زمان تولید محصول دارای شاخه‌های طویل و انشعابات فراوان بوده‌اند و این حالت برای آنها تا زمان وجود ترکیبات کافی محیط کشت وجود داشت؛ که در غلظت‌های 60%، 50%، 40%، 30% اوره تا روز هشتم و برای غلظت‌های 70% و 100% تا روز دهم این گونه بوده است. با ادامه فرایند و کاهش میزان مواد غذایی در محیط، مناطق غیر زنده در میسلیوم‌ها پدید آمده که تا نوک هیف‌ها پیش‌روی کرده و نواحی ترشح آنتی‎بیوتیک را غیر‎فعال نمودند در این حالت علاوه بر کاهش ترکیبات محیط که سبب از بین رفتن حالت میسلیومی شدند هم زدن پیوسته محیط نیز ممکن است سبب شکسته شدن تدریجی هیف‌ها شوند.
مقایسه وضعیت مورفولوژیک هیف‌های باکتری در میزان تولید اریترومایسین نشان داد در حالتی که هیف‌ها کاملا طویل و منشعب هستند میزان تولید اریترومایسین بیشترین مقدار بوده است و با کاهش طول آنها از حالت انشعابی و کوتاه‌تر شدن آنها به واسطه کمبود مواد غذایی و غیر فعال شدن هیف‌ها و شکستگی آنها طی