تحقیق درباره مورفولوژی، اولویت‌بندی

و دور ریخته شد. فاز آلی از یک قیف شیشه‌ای دارای صافی پنبه‌ای عبور داده شد و در یک ظرف درب‌دار جمع‌آوری شد.
3-8-5-4) تشکیل کمپلکس رنگی اریترومایسین با برموفنل‌بلو
در هر یک از ارلن‌های درپوش‌دار با حجم ml 100، به کمک پی‌پت‌های مجزا از محلول کلروفرمی استخراج شده در مرحله قبل ریخته شده و هم حجم آن، به آن محلول کار برموفنل‌بلو اضافه شده و به مدت 30 دقیقه در شیکر به هم زده شد تا واکنش اریترومایسین و برموفنل‌بلو تکمیل شود. محتویات هر ارلن در لوله‌های سانتریفوژ ریخته می‌شود. با سمپلر به دقت فاز آبی(یرموفنل‌بلو) جدا و دور ریخته ‌شد. فاز آلی(سفید/زردرنگ) در rpm 4000 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ ‌شد. فاز آبی احتمالی باقیمانده به دقت با سمپلر جدا و دور ریخته شد و فاز آلی برای مرحله بعد در ظروف دربسته نگهداری شد.

3-8-5-5) اندازه‌گیری میزان جذب کمپلکس رنگی اریترومایسین- برموفنل‌بلو
به کمک اسپکتروفتومتر، جذب کمپلکس رنگی اریترومایسین- برموفنل‌بلو در طول موج nm 415 سنجیده می‌شود. از فاز آلی مربوط به لوله (1) جدول که به روش فوق آماده شده بود، به عنوان شاهد (blank) استفاده شده است. غلظت اریترومایسین در نمونه‌ها با استفاده از منحنی استاندارد سنجیده شد.

فصل چهارم

همانطور که از عنوان پایان نامه نیز مشخص است، هدف از این پژوهش، ارزیابی کارایی اوره بعنوان یک منبع ارزان‌قیمت در تولید اریترومایسین است. برای این منظور از غلظت‌های مختلف اوره بجای سویا در محیط کشت استفاده شد و در هر مورد پارامترهای مختلفی مورد بررسی قرار گرفت.
میزان تولید اریترومایسین در روزهای نخست ناچیز است بنابراین برای اندازه گیری پارامترها که شامل درصد وزن تر بیومس، pH ، مورفولوژی میسلیوم‌ها و میزان اریترومایسین تولید شده می‌باشد نمونه گیری را از روز چهارم تخمیر شروع کرده و از آنجا که حجم نمونه داخل فلاسک ها کم بود و احتمال آلوده شدن نمونه‌ها در اثر برداشت‌های مکرر وجود داشت، این کار بصورت یک روز در میان و در روزهای چهار، شش، هشت و دهم تخمیر انجام گرفت و پارامترهای مورد نظر سنجیده شد.
در حال حاضر، در صنعت، برای تولید اریترومایسین از منبع نیتروژنی سویا استفاده می‌شود. بنابراین، از محیط تخمیر حاوی سویا به عنوان تنها منبع نیتروژنی، به عنوان نمونه شاهد یا کنترل استفاده شد تا در نهایت بتوان اثر غلظت‌های مختلف اوره در تولید اریترومایسین را با آن مقایسه کرد. مقدار سویای مورد نیاز برای ساختن محیط تخمیر به حجم ml 1000، 30 گرم است که در این پژوهش به نسبت های مختلف با اوره جایگزین شد.
به همین منظور، در ابتدا به بررسی میزان تولید اریترومایسین، pH، درصد وزن تر بیومس و تغییرات مورفولوژی میسلیوم‌ها در نمونه شاهد(حاوی 30 گرم آرد سویا ) می‌پردازیم و سپس به بررسی پارامترهای مورد نظر در تمامی غلظت‌های انجام شده پرداخته و در نهایت با مشخص کردن بهترین غلظت اوره در تولید اریترومایسین، این پارامترها را به تفکیک مورد بررسی قرار می‌دهیم.

4-1 ) بررسی اثر غلظت30 گرم‌درلیتر آرد‌سویا برروی پارامترهای مورد‌نظر در طی تخمیر
همانطور که گفته شد، در ابتدا به بررسی اثر غلظت 30 گرم در لیتر سویا به عنوان شاهد می‌پردازیم و اثر آن را روی پارامترهای مورد نظر می‌سنجیم.
4-1-1 ) بررسی اثر غلظت 30 گرم در لیتر آرد سویا بر روی pH محیط کشت تخمیر
در نمودار زیر نمودار تغییرات pH در محیط حاوی 30 گرم آرد سویا نشان داده شده است.
نمودار( 4-1): تغییرات pH در طی فرایندتولید اریترومایسین در محیط کشت حاوی 30 گرم در لیتر آرد سویا
همانطور که در نمودار (4-1) مشاهده می‌شود، pH در محیط کشت شاهد در روز چهارم 7 بوده و تا روز هشتم سیر صعودی دارد که این افزایش در روز هشتم به حداکثر خود یعنی 14/8 رسیده و پس از آن کاهش می یابد و در روز یازدهم به 87/7 می‌رسد.
4-1-2 ) بررسی اثر غلظت 30 گرم‌درلیتر آردسویا برروی درصد وزن‌تر‌بیومس در محیط تخمیر
نمودار (4-2) تغییرات درصد وزن تر بیومس را در طی تخمیر در روزهای مختلف نشان می‌دهد.
نمودار(4-2): تغییرات درصد وزن تر بیومس در طی فرایند تخمیر در محیط حاوی 30گرم در لیتر آرد سویا
همانطور که در نمودار (4-2) مشاهده می‌شود، درصد وزن تر بیومس در روز چهارم 72/24% بوده و در روز ششم مقدار آن افزایش یافته و تا روز هشتم به حداکثر میزان خود یعنی 49/35% می‌رسد. سپس مقدار آن کاهش یافته و در روز یازدهم به مقدار 43/27% رسیده است.
4-1-3 ) بررسی اثر غلظت 30 گرم در لیتر آرد سویا در میزان تولید اریترومایسین

نمودار( 4-3) : میزان اریترومایسین تولید شده در روزهای مختلف تخمیر در غلظت 30 گرم در لیتر آرد سویا

بررسی میزان اریترومایسین تولیدی در طی فرایند تخمیر با توجه به نمودار (4-3) نشان می‌دهد که میزان تولید در طی فرایند با صعود و نزول همراه است به این معنی که این مقدار از 32/76 میلی گرم در لیتر در روز چهارم شروع شده و به 51/124میلی گرم در لیتر در روز هشتم می‌رسد که بیشترین مقدار تولید اریترومایسین در این روز مشاهده شده است. سپس تا روز یازدهم روند نزولی داشته و این مقدار به 45/102 میلی گرم در لیتر می‌رسد.

4-1-4 ) بررسی اثر غلظت 30 گرم در لیتر آرد سویا بر روی مورفولوژی باکتری Saccharopolyspora erythraea
در این قسمت به بررسی مورفولوژی میسلیوم‌های Saccharopolyspora erythraea در طی فرایند تخمیر در غلظت 30 گرم در لیتر آرد سویا به عنوان نمونه شاهد می‌پردازیم. نمونه‌ها ابتدا به روش گرم رنگ‌آمیزی شده و برای مشاهده مورفولوژی آنها از میکروسکوپ نوری استفاده شد.
شکل( 4-1 ) مورفولوژی میسلیوم‌ها را در روز چهارم تخمیر نشان می‌دهد. در این روز، باکتری شروع به رشد میسلیومی کرده و هیف‌های آن در حال انشعاب هستند اما هنوز رشد میسلیومی کامل نشده و هیف‌های کوتاه هم دیده می‌شوند.

شکل(4-1): مورفولوژی میسلیوم ها در روز چهارم تخمیر

شکل ( 4-2) مورفولوژی میسلیوم‌ها را در روز ششم تخمیر نشان می‌دهد. در این روز، میسلیوم‌ها به طور کامل رشد کرده‌اند و منشعب هستند. همچنین طول میسلیوم‌ها بلند است.

شکل(4-2): مورفولوژی میسلیوم ها در روز ششم تخمیر

شکل (4-3 ) مورفولوژی میسلیوم‌ها را در روز هشتم نشان می‌دهد. در این روز، میسلیوم‌ها هنوز منشعب بوده و طول بلندی دارند اما در بعضی نقاط، تجزیه و کاهش طول تعداد کمی از آنها مشاهده می‌شود.
شکل(4-3): مورفولوژی میسلیوم‌ها در روز هشتم
شکل ( 4-4 ) مورفولوژی میسلیوم‌ها را در روز دهم تخمیر نشان می‌دهد. در این روز، طول میسلیوم‌ها کوتاهتر از میسلیوم‌ها در روز هشتم است ومیسلیوم‌ها در برخی قسمت ها قطعه قطعه شده و طول و تعداد انشعابات آنها نسبت به روز هشتم کاهش یافته است.
شکل(4-4 ): مورفولوژی میسلیوم‌ها در روز دهم تخمیر
شکل ( 4-5 ) مورفولوژی میسلیوم‌ها را در روز یازدهم تخمیر نشان می‌دهد. در این روز، میسلیوم‌ها تجزیه شده‌اند، هیچ طول بلند یا حالت انشعابی دیده نمی‌شود و میسلیوم‌های مجزا و پراکنده که دارای طول کوتاه هستند مشاهده می‌شوند.

شکل(4-5 ): مورفولوژی میسلیوم ها در روز یازدهم تخمیر
4-2 )سنجش و مقایسه همزمان پارامترهای مورد بررسی در تمام غلظت‌ها در طی فرایند تخمیر
همانطور که قبلا ذکر شد، در صنعت برای تولید اریترومایسین از منبع نیتروژنی سویا استفاده می‌شود که مقدار مورد نیاز آن برای حجم 1000 میلی لیتر ، 30 گرم می‌باشد. در این پژوهش، غلظت های مختلف اوره جایگزین این منبع شد.
جدول ( 4-1 ) : غلظت‌های مختلف اوره و سویا استفاده شده در حالت‌های مختلف
نوع حالت
غلظت سویا ( گرم در لیتر)
غلظت اوره (گرم در لیتر)
100% اوره
0
30
70% اوره
21
9
60% اوره
18
12
50% اوره
15
15
40% اوره
12
18
30% اوره
9
21
شاهد
30
0
در ادامه، تمامی داده‌ها و حالت‌ها را با یکدیگر و با نمونه حاوی 30 گرم در لیتر کنجاله سویا ( شاهد ) بطور همزمان مقایسه کرده تا اولویت‌بندی صورت گیرد و بهترین حالت از نظر میزان تولید اریترومایسین مشخص شود.

4-2-1 ) سنجش و مقایسه pH در حالت‌های مختلف
همانطور که در نمودار (4-4) دیده می‌شود، در غلظت‌های اوره 50% ، 40% و 30 % شاهد افزایش pH از روز چهارم تا روز هشتم بودیم که به ترتیب به میزان 7/8 ، 4/8 ، 8/8 می‌باشد. سپس شاهد کاهش آن بوده که در روز یازدهم به ترتیب به مقدار 1/8 ، 9/7 و 8/7 رسیده است.
در غلظت‌های اوره 100% ، 70 % و 60% ، مقدار pH در روز ششم به حداکثر مقدار خود رسیده که به ترتیب شامل 1/9 ، 9/8 و 9 می‌باشد و از روز هشتم کاهش می‌یابد تا در روز یازدهم به ترتیب به 4/8 ، 2/8 ، 3/8 می‌رسد.
نمودار(4-4): تغییرات pH محیط کشت در طی فرایند تخمیر در غلظت‌های مختلف
4-2-2 ) سنجش و مقایسه درصد وزن تر بیومس تولید شده در حالت‌های مختلف
نمودار (4-5) ، تغییرات درصد وزن تر بیومس تولید شده را در غلظت‌های مختلف طی فرایند تخمیر نشان می‌دهد.
نمودار(4-5): درصد وزن تر بیومس تولید شده در غلظت های مختلف طی فرایند تخمیر
همانطور که در شکل(4-12) مشاهده می‌شود، روند تغییرات بیومس برای حالت‌های مختلف متفاوت است. در غلظت‌های 30%، 40%، 50% و 60% اوره، شاهد افزایش بیومس تا حدود روز هشتم بودیم در حالیکه در غلظت‌های 70% و 100% این روند تا روز دهم ادامه داشته است. سپس مقدار آن در روزهای انتهایی کاهش یافته است.

4-2-3 ) سنجش و مقایسه میزان اریترومایسین تولید شده در حالت‌های مختلف
نمودار (4-6 )، میزان اریترومایسین تولید شده را در غلظت‌های مختلف طی فرایند تخمیر نشان می‌دهد.
نمودار(4-6) : میزان اریترومایسین تولید شده در غلظت های مختلف طی فرایند تخمیر
همانطور که مشاهده می‌شود، استفاده از غلظت‌های مختلف اوره و سویا به عنوان منبع نیتروژنی منجر به تولید مقادیرمتفاوتی از اریترومایسین شده است. علاوه بر این، چنانچه از نمودار (4-6 ) مشخص است، تغییر غلظت‌ها بر روی مدت زمان فرایند تخمیر نیز تاثیرگذار بوده است که منجر به این شده که در روزهای متفاوتی شاهد بیشترین مقدار تولید اریترومایسین باشیم. بطور مثال، در غلظت اوره 70% و 100% بیشترین میزان تولید اریترومایسین را در روز دهم داشتیم و در باقی غلظت ها، حداکثر میزان تولید در روز هشتم مشاهده شد.

4-2-4 ) تعیین غلظت بهینه اوره و سویا برای محیط کشت تولید اریترومایسین
چنانچه در نمودار (4-6) مشاهده می‌شود، می‌توان نتیجه گرفت که در غلظت 40% اوره و 60% سویا شاهد بیشترین مقدار تولید اریترومایسین هستیم که مقدار آن در روز هشتم تخمیر به حداکثر مقدار خود یعنی 05/118 رسیده است. بعد از این غلظت، به ترتیب غلظتهای50% و 30 % رشد بهتری داشتند. پس می‌توان گفت بهترین حالت غلظت‌های مورد استفاده برای تولید اریترومایسین، غلظت 40% اوره است.

4-2-4-1)بررسی پارامترهای مختلف برای غلظت بهینه(40% اوره) در تولید اریترومایسین
همانطور که از نمودارها بدست آمد، در غلظت اوره 40% بیشترین میزان تولید اریترومایسین مشاهده شد. در ادامه به بررسی نموارهای مربوط به این غلظت بهینه بصورت منفرد می‌پردازیم.

4-2-4-1-1) بررسی اثر غلظت بهینه (40% اوره) در میزان تولید اریترومایسین
نمودار (4-7)، میزان اریترومایسین تولید شده را در حضور 40% درطی فرایند تخمیر نشان می‌دهد.

نمودار(4-7): میزان اریترومایسین تولید شده را در حضور 40% درطی فرایند تخمیر
چنانچه در نمودار دیده می‌شود مقدار تولید اریترومایسین در روز چهارم 59/71 بوده که مقدار آن طی فرایند تخمیر افزایش یافته و در روز هشتم به حداکثر مقدار خود یعنی 05/118 می‌رسد. سپس مقدار آن کاهش یافته و در روز یازدهم به 2/100 می‌رسد.

4-2-4-1-2 ) بررسی اثر غلظت بهینه (40% اوره) بر روی pH محیط کشت
نمودار (4-8)، تغییرات pH را در حضور 40% اوره درطی فرایند تخمیر نشان می‌دهد.

نمودار(4-8): تغییرات pH در حضور 40% اوره درطی فرایند تخمیر
همانطور که در نمودار مشاهده