میکروارگانیسم‌ها قرار می‌دهند، شامل دانه‌های سویا، کنجاله سویا، کنجاله بادام زمینی، کنجاله تخم پنبه، بقایای حاصل از تقطیر الکل، عصاره مخمر، شربت ذرت خیسانده ( CSL ) و ژلاتین می‌شود.
کنجاله سویا، بقایای حاصل از استخراج روغن از دانه سویا است. کنجاله بادام زمینی و تخم پنبه نیز به ترتیب، بقایای حاصل از استخراج روغن از بادام زمینی و پنبه دانه است.
بقایای حاصل از تقطیر الکل از تخمیر الکلی روی ملاس یا غلات دارای نشاسته و جداسازی الکل و توده زیستی به دست می‌آید. در بسیاری از کشورها، این بقایا به عنوان خوراک دام یا کود به کار می‌رود ، اما استفاده از آنها به عنوان منبع نیتروژن در محیط‌کشت نیز امکان پذیر است.
عصاره مخمر در اثر خودکافت یا پلاسمولیز مخمر نان یا مخمر جداسازی شده از تخمیر الکلی به دست می‌آید. عصاره مخمر به شکل خشک یا به شکل خمیری در دسترس است.
شربت ذرت خیسانده (CSL) محصول جانبی کارخانجات استخراج نشاسته از ذرت و از با ارزشترین ترکیباتی است که به عنوان منبع ازت در صنایع تخمیری مختلف به کار گرفته می‌شود.
CSL حاوی اسیدهای آمینه ضروری، ویتامین‌ها و نمک‌های معدنی است (47).
در جدول زیر، برخی از منابع نیتروژن مورد استفاده برای تولید تعدادی از متابولیت‌های ثانویه آورده شده است.
جدول(1-4) : مهمترین منابع نیتروژن برای تولید تعدادی از متابولیت های ثانویه
محصول
منابع اصلی نیتروژن مورد استفاده
پنی سیلین
شربت ذرت خیسانده
باسیتراسین
کنجاله بادام زمینی
ریبوفلاوین
ژلاتین هضم شده به وسیله پانکراتین
نووبیوسین
بقایای حاصل از تقطیر الکل
ریفامایسین
کنجاله سویا و (NH4)2SO4
ژیبرلین
نمک آمونیوم و منبع طبیعی نیتروژن گیاهی
بوتیروسین
خون خشک شده گاو یا مخلوط هموگلوبین با (NH4)2SO4
پلی ان ها
کنجاله سویا
1-21-3) هیدروژن و اکسیژن
هیدروژن در تمام ترکیبات آلی و آب درون سلول وجود دارد و برخی از باکتری‌های متان‌زا و باکتری‌های هیدروژن از مولکول هیدروژن به عنوان منبع انرژی استفاده می‌کنند.
اکسیژن در تمامی ترکیبات آلی سلول و آب موجود در سلول حضور دارد. معمولا اکسیژن به وسیله منبع کربن تامین می‌شود اما برای میکروارگانیسم‌هایی که از هیدروکربن‌ها به عنوان منبع کربن استفاده می‌کنند اکسیژن مولکولی مورد نیاز است(31).
1-21-4) مواد معدنی
کلیه میکروارگانیسم‌ها برای رشد و سوخت و ساز به عناصر معدنی مشخصی نیاز دارند. در بسیاری از محیط‌های کشت، منگنز، فسفر، پتاسیم، گوگرد، کلسیم و کلر اجزای ضروری هستند و باید به صورت جداگانه به محیط‌کشت اضافه شوند. مواد معدنی دیگری مانند کبالت، مس، آهن، منگنز، مولیبدن و روی نیز برای میکروارگانیسم‌ها ضروری است اما معمولا به اضافهسازی جداگانه نیاز نیست و به شکل ناخالصی در اجزای محیط کشت حضور دارند(29).
فسفر معمولا به صورت یون PO3-4 در میکروارگانیسم‌ها مصرف می‌شود و علاوه بر آن، این ترکیب نقش بافر کننده محیط کشت را نیز ایفا می‌کند. به دلیل اثری که بر تشکیل بسیاری از متابولیت‌های ثانویه دارد، فسفر به عنصری کلیدی در بسیاری از فرایندهای میکروبی صنعتی تبدیل شده است.
اغلب باکتریها و قارچها برای تامین گوگرد مورد نیاز می‌توانند SO2-4 معدنی را مصرف کنند. منبعی مفید برای گوگرد محیط کشت، (NH4)2SO4 است که اغلب به عنوان منبع نیتروژن نیز استفاده می‌شود.
پتاسیم، کاتیون معدنی اصلی در سلول است.
منیزیم معمولا به شکل MgSO4.7H2O تامین می‌شود(47).
1-22) تنظیم‌کننده‌های متابولیکی
علاوه بر آن چه تا اینجا ذکر شد، در موارد خاصی به افزودن مواد دیگری به محیط کشت نیاز است. این اجزای محیط‌کشت، تنظیم تولید محصول را به عهده دارند و در تقویت رشد میکروارگانیسم‌ها موثر نیستند. این مواد افزودنی عبارتند از: پیش‌سازها، مهارکننده‌ها و محرک‌ها. می‌توان از این مواد به منظور پیشرفت تخمیر استفاده کرد(47).
1-23) ضد کف‌ها
علت اصلی تشکیل کف در فرمنتورها، وجود پروتئین در محیط‌کشت است. این پروتئین‌ها در تماس با هوا از حالت طبیعی خارج می‌شوند و تشکیل کف می‌دهند و به راحتی از بین نمی‌روند. کف می‌تواند موجب خروج سلول‌ها از محیط کشت و خودکافت شدن آنها شود. این عمل موجب آزادی پروتئین‌های سلولهای میکروبی می‌شود که پایداری کف تشکیل شده را افزایش می‌دهند. اگر کف در فرمنتورها کنترل نشود، موجب مرطوب شدن صافی‌های هوا و آلودگی محیط فرمنتور می‌شود(31).
ترکیبات زیر بهترین مواد ضد کف برای فرایندهای تخمیری است:
الکل ها، استئاریل و اکتیل دکانل
استرها
اسیدهای چرب و مشتقات مربوط، خصوصا گلیسیریدها شامل روغن تخم پنبه، روغن تخم کتان، روغن سویا، روغن خرما و روغن کرچک
سیلیکون‌ها
سولفونات‌ها
پلی پروپیلن گلیکول، اکسازالین و غیره
1-24) طراحی و فرمول‌بندی محیط کشت
در محیط‌کشتی با خصوصیت‌های فیزیکی و تغذیه‌ای مناسب، مادامی که غلظت مواد مغذی به کمتر از مقدار محدود‌کننده کاهش نیابد یا غلظت مواد سمی از حد مجاز بالاتر نرود، میکروارگانیسم با سرعت مشخص به رشد خود ادامه می‌دهد. تغییر در وضعیت محیطی در نتیجه رشد میکروارگانیسم یا تغییر در وضعیت فیزیکی یا شیمیایی، به کاهش سرعت رشد میکروارگانیسم منجر می‌شود(35).
طراحی محیط کشت کاری پیچیده است که در گذشته توجه نمیشد. آن چه معمولا در این حالت‌ها انجام می شد صرفا انتخاب ترکیب اجزای محیط‌کشت بر اساس آزمایش‌ها و نظریه‌ها و محیط‌کشت‌های موفق قبلی بود(31).
کلمه طراحی در اینجا بیانگر اولین مرحله توسعه محیط‌کشت است که به انتخاب اجزای محیط‌کشت منجر می‌شود. در مرحله طراحی توجه به اهمیت اجزای محیط‌کشت بر رشد میکروارگانیسم و تشکیل محصول ضروری است و باید به کلیه اطلاعات در دسترس در مورد میکروارگانیسم، مواد خام و فرایند مورد استفاده و تاثیر این عوامل بر مراحل مختلف رشد توجه شود. منظور از کلمه فرمول‌بندی، محاسبه غلظت اجزای محیط‌کشت با توجه به ترکیب جرمی سلول‌ها، استوکیومتری رشد و تشکیل محصول، ضرایب بازده و سایر عوامل است.
فرمول‌بندی محیط‌کشت یکی از مراحل اساسی در خلال آزمایش‌های موفق در آزمایشگاه، مرحله نیمه صنعتی و فرایندهای صنعتی است. اجزای محیط کشت باید نیازهای رشد سلولی، تولید متابولیت و از طرف دیگر انرژی مورد نیاز را برای بیوسنتز و نگهداری سلول فراهم کنند(9).
1-25) فرایند تخمیر تولید آنتیبیوتیک
1-25-1) مراحل کلیدی فرایند تولید یک نوع آنتیبیوتیک
از آنجایی که تولید کنندگان آنتیبیوتیک ذاتا دوست ندارند که تکنولوژی آنها برای تولید محصولات دیگر استفاده شود، بنابراین این بخش نمی‌تواند گزارش جامعی از همه روشهای استفاده شده برای تولید آنتی‌بیوتیک‌ها بدهد. بنابراین هدف از این بخش تنها دادن یک گزارش از روشهایی است که به خوبی شناخته شده‌اند و بطور معمول در صنعت استفاده می‌شوند.
1-25-2) بخش‌های اصلی فرآیند تخمیری:
صرف نظر از نوع تخمیر، فرآیندهای تخمیری به طور کلی به مراحل زیر تقسیم می‌شود:
فرآیندهای بالا دستی
این بخش از فرآیند شامل مراحل فرعی زیر است:
انتخاب میکروارگانیسم صنعتی یا توسعه میکروارگانیسم تا حصول میکروارگانیسم صنعتی با روشهای مختلف
انتخاب محیط کشت مناسب صنعتی، ارزان، فراوان و مناسب از نظر رشد و تولید محصول
تنظیم ترکیب محیط کشت با توجه به وضعیت موجود برای مرحله توسعه مایه تلقیح و تخمیر اصلی
سترون‌سازی محیط و لوازم کشت
توسعه مایه تلقیح مناسب
تأمین تجهیزات و لوازم کل فرآیند
افزودن مایه تلقیح به محیط کشت سترون شده
فرایند تخمیر
این مرحله شامل رشد میکروارگانیسم یا کشت سلول به منظور تولید محصول با توجه به وضعیت تعیین شده قبلی است که عبارت است از:
کنترل فرآیند در حین تخمیر
انتخاب زمان مناسب برای خاتمه تخمیر در وضعیت غیر مداوم
حفظ وضعیت سترون در حین تخمیر
تأمین مواد افزودنی در حین تخمیر
این کار در انواع مختلفی از بیوراکتورها انجام می‌گیرد شامل :
1- بيوراكتورهاي مخزني 2- همزن دار 3- ستوني حباب دار 4- هواگرد
فرآیند پایین دستی
جداسازی توده زیستی
تخریب دیواره سلولی برای آزادسازی محصولات درون سلولی و درون دیواره سلولی
تغلیظ محصول
خالص‌سازی محصول از بخش مایع با روشهای گوناگون
کنترل کمی و کیفی محصول
بسته بندی
سترون‌سازی پساب در صورت استفاده از ارگانیسم‌های تراریخته
تصفیه پساب(33)
مراحل کلیدی فرایند تولید یک نوع آنتیبیوتیک در جدول (1-5) نشان داده شده است. این جدول نوع و مقیاس هر مرحله به اضافه یک اشاره در ارتباط با سنجش و توسعه برای رسیدن به کارایی بهینه فرایند را شرح می‌دهد.
یک گونه میکروارگانیسم با راندمان بالا لازمه هر فرایند تولید آنتیبیوتیک است. تغییرات پی در پی در شرایط فرایند منجر به بهبود یکنواخت در بازدهی می‌گردد اما بهره‌وری مراحل بزرگ معمولا با استفاده از یک گونه بهتر، بهبود داده می‌شود. بنابراین تولیدکنندگان آنتیبیوتیک، برای ترقی دادن گونه‌های با راندمان بالاتر همواره تلاش می‌کنند(49).
گونه انتخاب شده، باید برای ذخیره‌سازی طولانی مدت به وسیله روشهایی که برای حفظ کردن خواص مطلوب گونه امتحان شده، نگهداری شود.
کشت حفظ شده نیز یک سرمایه با ارزش است و با صرفه‌جویی ممکن مصرف می‌گردد. بنابراین تلقیح کردن یک فرمانتور بزرگ به طور مستقیم با مقادیر زیاد از مواد نگهداشته شده برای بدست آوردن رشد مناسب، مطلوب نیست. معمولا کمترین مقدار ممکن برداشته می‌شود و مقدار مواد به وسیله رشد دادن روی سطوح جامد یا محیط‌کشت مناسب توسعه داده می‌شود(12).
مایه تلقیح عموما به شکل سوسپانسیون اسپوری است که ممکن است چند روز قبل از تلقیح آماده شود. احیانا برای ارگانیسم‌های معینی، ممکن است استفاده کردن از یک مایه تلقیح رویشی ضروری باشد که قبل از انتقال دادن به داخل فرمانتور فورا تهیه می‌گردد(31).
جدول(1-5): مراحل کلیدی فرایند تولید یک نوع آنتی بیوتیک(31)
کار حمایتی ( پشتیبانی)
مرحله فرایند
مقیاس و نوع عملیات
بهبود گونه
توسعه روش
آزمایش برای آلودگی ها
توسعه محیط کشت
توسعه محیط کشت
توسعه فرایند
آزمایش برای آلودگی ها
پایش بیوشیمیایی و میکروبیولوژیکی
توسعه محیط کشت
توسعه فرایند
آزمایش برای آلودگی ها
پایش بیوشیمیایی و میکروبیولوژیکی
طراحی و توسعه تجهیزات
سرویس سنجش
توسعه فرایند
طراحی و توسعه تجهیزات
سرویس سنجش
حفظ و نگهداری کشت
تهیه مایه تلقیح
مرحله بذر
مرحله نهائی
برداشت محصول
استخراج و خالص سازی
لیوفیلیزاسیون
خشک کردن روی خاک یا اسلوپهای سیلیکاژل
حفظ کردن در نیتروژن مایع
<10 lit فلاسک ها یا قوطی های استیلی مایه تلقیح
<20m3 فرمانتور از جنس فولاد ضد زنگ
فرمانتور از جنس فولاد ضد زنگ
10-300 m3
فیلتراسیون استوانه ای دوار
فیلتراسیون Belt
فیلتراسیون غشائی
سانتریفیوژکردن
استخراج کل مایع تخمیری
در یک عملیات تجاری، هدف داشتن فرمانتورهای نهائی بزرگ تولید کننده آنتیبیوتیک برای یک زمان ماکزیمم می‌باشد. به هر حال در شروع تخمیر یک زمان معینی برای رشد دادن ارگانیسم، تا وقتی که یک مقدار خیلی کمی آنتیبیوتیک تولید شده لازم است.
برای بهینه کردن بهره‌وری فرمانتور، معمول است که قسمتی از فاز رشد را به یک فرمانتور جدائی ( فرمانتور مرحله بذر) منتقل می‌کنند. بسته به فرایند و گونه میکروارگانیسم، ممکن است بیشتر از یک مرحله بذر لازم باشد اما در همه حالات هدف یکسان می‌باشد و آن تولید کردن ماکزیمم مقدار بیومس در یک حالت متابولیکی مناسب برای رفتن به مرحله نهائی است(49).
به هر حال، آنتی‌بیوتیک‌ها متابولیت‌های ثانویه هستند. بنابراین برای بدست آوردن ماکزیمم بهره‌وری، محدود کردن رشد آنها و سوق دادن ارگانیسم به طرف متابولیسم ثانویه ضروری است. این معمولا به وسیله طراحی محیط‌کشت، طوری که یک ماده مغذی کلیدی در یک زمان مقتضی تمام گردد و تولید متابولیسم دلخواه آغاز گردد، فراهم می‌شود(28).
انتخاب ماده مغذی کلیدی مهم می‌باشد و بین فرایندهای مختلف تغییر می‌کند. گلوکز در حالت تولید پنی‌سیلین و فسفات برای یک تعداد از آنتی‌بیوتیکهای تولید شده به وسیله استرپتومایستها ماده مغذی کلیدی هستند.
در خیلی از تخمیرهای قارچها و استرپتومایستها فرایند به صورت غیر مداوم همراه با خوراک‌دهی عمل می‌شود که فاز بار آور ( فاز تولید) به وسیله تغذیه کردن مواد مغذی در طول فرمانتاسیون توسعه داده می‌شود.
این عمل در یک روش کنترل شده، طوری که ضروریات حفظ ارگانیسم فراهم شده ولی رشد بیشتر آن محدود شود، انجام می‌گردد(31).
تاکنون هیچ آنتی‌بیوتیکی شناخته نشده که به طور تجاری به وسیله کشت پیوسته تولید شود، اگرچه این روش به طور وسیعی برای کارهای تجربی در صنعت استفاده می‌شود.
در انتهای تخمیر، محتویات مایع تخمیری نه تنها مواد آنتیبیوتیک و میکروارگانیسم‌ها هستند بلکه یک تعداد زیادی مواد شیمیایی دیگر نیز هستند. در حقیقت آنتیبیوتیک ها یک جزء کوچکی از کل محیط کشت (35-3 % از کل حل شونده‌ها در مایع تخمیری) هستند.
مرحله اول در بازیافت آنها معمولا جداکردن فاز مایع از میکروارگانیسم‌ها به وسیله فیلتراسیون یا سانتریفیوژ کردن است ولی به هر حال در حالت‌های خاص ترجیح داده می‌شود که آنتیبیوتیک بطور مستقیم از کل مایع تخمیری استخراج شود.
روشهای مورد استفاده در جریان پایین دستی که برای جداسازی و خالص سازی آنتی‌بیوتیک‌ها استفاده می‌شود ممکن است شامل استخراج با حلال، تعویض یون، اولترافیلتراسیون، اسمز معکوس، ته نشینی و کریستالیزاسیون باشد.
سرانجام توده محصول خشک می‌شود و برای تهیه کردن مشتقات یا برای تولید مواد داروئی استفاده می‌گردد(31).
1-25-3) تهیه مایع تلقیح و فرایند توسعه آن
دو فاز توسعه داده شده که در کشت‌های میکروارگانیسم‌ها برای تولید متابولیت‌های ثانویه تصدیق شده‌اند عبارتند از:
الف – فاز رویشی یا trophophase : در این کشت یک رشد سریع و یک تولید ناچیز آنتیبیوتیک وجود دارد.
ب – فاز تخمیری یا idiophase : در این نوع کشت، کشت ساکن و تولید آنتیبیوتیک شروع می‌شود(16).
به چند دلیل فاز رشد رویشی تا حد امکان در یک ظرف جدا از فاز تولیدی انجام می‌شود که عبارتند از :
حداقل کردن خطر آلودگی :
اگر مرحله نهایی با استفاده از یک بیومس بزرگ تلقیح شود یک تعداد سلولهای آلوده که در استریلیزاسیون هوا یا محیط کشت زنده مانده‌اند تاثیر ناچیزی خواهند داشت.
اندازه و حالت متابولیکی بیومس
به تجربه ثابت شده که در تولید آنتیبیوتیک راندمان نهایی بطور قابل‌ملاحظه‌ای به وسیله اندازه و حالت متابولیکی بیومس استفاده شده به عنوان مایه تلقیح برای شروع مرحله تخمیر، تحت تاثیر قرار داده می‌شود (47).
استوکهای ذخیره شده یک سرمایه گرانبها هستند به همین دلیل کوچکترین مقدار ممکن برداشته می‌شود و مقدار آن به وسیله کشت دادن روی سطوح جامد یا در محیط‌کشت مایع، بسط داده می‌شود. به هر جهت باید به خاطر داشته باشیم که هر چه تعداد مراحل بین مواد حفظ شده و مرحله نهائی بیشتر باشد شانس کم شدن بهره‌وری ارگانیسم بیشتر است.
معمولا یک نمونه استوک حفظ شده روی اسلنت‌های آگار، از محیط‌کشتی که بخصوص برای این مرحله ساخته شده، پخش می‌شود. این اسلنت‌ها تحت شرایطی تجربی که به دقت کنترل می‌شود برای رشد و اسپورزایی گرمخانه‌گذاری می‌شوند. در همه مراحل تهیه مایه تلقیح، ثبات خیلی مهم است زیرا یک فرایند تولید روی یک نظم خاصی انجام می‌شود و هر وقفه، به خاطر اسپورزایی نامناسب، نتیجه نامطلوبی روی برنامه بخش تولید می‌گذارد(18).
داشتن مقادیر بالای اسپور تولید شده، یک روش موثر لازم دارد. اسپورهای محیط کشت مایع را می‌توان به وسیله فیلتراسیون از میان پشم شیشه برای حذف کردن مواد رویشی جمع کرد.
شستشو دادن محیط‌کشت برای بازیافت اسپورها از سطوح جامدی که رشد را تقویت نمی‌کنند استفاده می‌شود. بنابراین از یک محلول نمکی ساده می‌توان برای شستشو استفاده کرد. این محلول می‌تواند شامل یک سورفکتانت برای جلوگیری کردن از متراکم شدن اسپورها باشد. خیلی از سورفکتانت‌ها به میکروارگانیسم‌ها زیان می‌رسانند بنابراین دقت زیادی در انتخاب یک سورفکتانت برای این هدف لازم است(19).
حجم بهینه مایه تلقیح باید بطور تجربی برای تخمیرهای مختلف تعیین شود. در بیشتر حالات، حجم بهینه مایه تلقیح در محدوده 1% تا 10% حجم تخمیر بوده است بنابراین یک تخمیر انجام شده در فرمانتور m3 10 ممکن است یک مایه تلقیح چند هزار لیتری لازم داشته باشد که این را می‌توان به راحتی تنها به وسیله یک سیستم چند مرحله‌ای تهیه کرد(63).
کشت‌های شیک فلاسک برای تلقیح کردن فرمانتورهای کوچک استفاده می‌شوند و آنها نیز به عنوان مایه تلقیح برای فرمانتورهای بزرگترو به همین ترتیب استفاده می‌شود و تا 4 مرحله ممکن است برای تهیه کردن مایه تلقیح نهایی ضروری باشد(47).
هدف اصلی فرایند توسعه مایه تلقیح، زیاد کردن غلظت میسلیوم است. محیط‌های کشت پیچیده معمولا برای رشد دادن کشت‌های رویشی برای بدست آوردن سریع یک بیومس بزرگ استفاده می‌شوند. از آنجایی که تولید آنتیبیوتیک در این مرحله مطلوب نیست ( برای جلوگیری از منابع کربن و نیتروژن که به سمیت زایی خودکار یا بازدارندگی پس‌خور)، غلظت‌های نسبتا بالایی از منابع کربن و نیتروژن که به سرعت جذب می‌شوند( گلوکز، پپتون، عصاره مخمر، یونهای آمونیوم )و فسفات‌ها را می‌توان بکار برد(63).
مرحله متابولیکی مایه تلقیح نیز مهم است. کشت‌ها در فاز لگاریتمی رشد، معمولا بهترین کارایی را دارند. یک جنبه تخمیر نهایی که به وسیله کیفیت کشت رویشی تحت تاثیر قرار داده می‌شود، شکل فیزیکی رشد میسلیوم است.
مرحله نهایی تهیه مایه تلقیح، انتقال سوسپانسیون اسپوری داخل یک ظرف مناسب برای اضافه کردن به فرمانتور است. در حالت فرمانتورهای آزمایشگاهی، انتقال دادن مایه تلقیح از یک فلاسک شیشه‌ای به فرمانتور کافی است اما این برای فرمانتورهای بزرگ کافی نیست. معمولا آنجا فشار، بالای اتمسفر نگه داشته می‌شود و خطر ترکیدن ظرف شیشه‌ای وجود دارد. این خطر را می‌توان به وسیله کم کردن فشار فرمانتور از بین برد ولی خطر آلودگی زیاد می‌شود. بنابراین معمول است که از یک ظرف فلزی برای فرایند انتقال استفاده شود(15).
1-25-4) مرحله بذر (Seeding )
این فرمانتور به خاطر اینکه نیازی به تجهیز شدن به سیستم‌های تغذیه ندارد معمولا ساده تر و کوچکتر طراحی می‌شود و بسته به مدت مرحله تولید و روش عملیات، یک ظرف بذر می‌تواند بین دو تا شش فرمانتور مرحله نهایی را سرویس دهد. محیط کشت مرحله بذر نه تنها برای پرورش دادن سریع رشد بلکه برای جلوگیری کردن از تولید آنتی‌بیوتیک‌ها و همچنین جلوگیری کردن از اسپورزائی، توسعه داده می‌شود. مایه تلقیح برای مرحله بذر به دقت کنترل می‌شود. میزان درست مایه تلقیح می‌تواند منجر به این شود که یا رشد کافی نباشد و یا یک رشد نامناسب داشته باشد(54).
رشد در مرحله بذر به دقت کنترل می‌شود تا مطمئن شویم که میکروارگانیسم در حالت متابولیکی صحیح، برای کارایی بهینه در مرحله نهایی، انتقال داده می‌شود و در خیلی از حالت‌ها این انتقال در طول فاز رشد لگاریتمی صورت می‌گیرد ولی این برای همه حالت‌ها نیست و بسته به فرایند و گونه استفاده شده دارد. ارزیابی‌های رشد و فعالیت متابولیکی زیاد هستند و تفاوت می‌کنند و شامل ویسکوزیته، رسوب، تغییرات pH ، زمان، مصرف اکسیژن، خروج دی اکسید کربن، ماکزیمم نیاز اکسیژن، پتانسیل اکسیداسیون و احیاء، میزان ATP، محتوی DNA و سنجش واکنشهای خاص هستند. سیستم‌های مناسبتر برای هر فرایند باید بطور تجربی تعیین شوند و یک بار اجرا شوند و شرایط انتقال باید به دقت اعمال شوند. هنگامی که می‌خواهیم مواد مرحله بذر را به فرمانتور نهایی منتقل کنیم یک حجم مناسب بین 1% و 20% حجم مرحله نهایی به عنوان مایه تلقیح اولیه مرحله نهایی به فرمانتور تولید منتقل گردد. استفاده از محیط کشت ناهمگن امکان آلودگی اسپورهای باقی مانده بعد از فرایند استریلیزاسیون را افزایش می‌دهد.
مرحله بذر برای جوانه زدن و رشد ارگانیسم‌های آلوده کننده آسیب پذیر‌تر از مرحله نهایی است. چونکه به مرحله نهایی غلظت بالایی از مایه تلقیح در حال رشد سریع تولید کننده یک آنتیبیوتیک که می‌تواند مقادیر کم ارگانیسم‌های آلوده کننده را از بین ببرد ، اضافه می‌شود(12).
در مرحله بذر، شرایط برای پرورش دادن سریع طراحی می‌شود و پیدا کردن یک آلوده کننده که از ارگانیسم مطلوب زودتر رشد می‌کنند، آسان است و ضروری است که یک بذر آلوده شده به محیط‌کشت مرحله تولید منتقل نشود. از دست دادن یک مرحله بذر آلوده منجر به از دست دادن هزینه و زمان است اما این در مقایسه با از دست دادن هزینه و زمانیکه در نتیجه آن از مرحله نهایی آلوده شده به دست می‌آید کوچک است.
مراقبت زیادی در رابطه با آلودگی‌های ممکن سرتاسر مرحله بذر، بوسیله مشاهده کردن با میکروسکوپ و بوسیله آزمایش روی فازهای محیط کشت جامد و مایع، معمولا در بیشتر از یک دما انجام می‌شود(31).
1-25-5) مرحله نهایی (مرحله تولید)
مرحله نهایی تخمیر، کانون عمده هزینه عملیات تولید کردن آنتی بیوتیک است. یک واحد تخمیری کارگر زیادی ندارد و هزینه کمتر از 15% هزینه کل است. هزینه‌های انرژی برای همزدن و هوادهی و هزینه مواد مغذی بخش عمده هزینه عملیاتی هستند. در حالی که کم کردن هزینه‌های تولید مهم است ولی باید در نظر داشته باشیم که چون آنتی‌بیوتیک‌ها مواد گرانی هستند، یک افزایش کم در بهره‌وری، مزایای بیشتری نسبت به صرفه‌جویی‌های کوچک در استفاده از مواد خام یا توان دارد(57).
همه آنتی‌بیوتیک‌ها به وسیله تخمیرهای غیر پیوسته و غیر پیوسته همراه با خوراک‌دهی تولید می‌شوند و کشت‌های پیوسته تا کنون تنها به عنوان یک ابزار در مطالعات تجربی استفاده شده‌اند.
روشهای غیر پیوسته همراه با خوراک‌دهی برای بسط دادن مدت و بهره‌وری تخمیر استفاده می‌شوند. در این روشها یک ماده مغذی مانند گلوکز بطور پیوسته سرتاسر تخمیر اضافه می‌شود که می‌تواند منجر به تولید آنتیبیوتیک برای بالای 350 ساعت گردد(31).
اگر همه گلوکز در شروع تخمیر یکدفعه داخل محیط‌کشت ریخته شود، رشد زیاد منجر به ویسکوزیته بالا می‌گردد که بطور محسوس بر انتقال اکسیژن، اختلاط و در نتیجه کم شدن بهره‌وری تاثیر می‌گذارد. روش غیر پیوسته همراه با خوراک‌دهی، رشد را کنترل می کند و مشکلات بازدارندگی کاتابولیست را برطرف می‌کند. اضافه کردن مواد مغذی می‌تواند به وسیله پمپ‌های اندازه گیری کننده، فلومترها یا بورت‌ها انجام شود. سرعت تغذیه ضرورتا در تمام مدت تخمیر یکسان نیست و با توجه به نیاز، کنترل کردن میزان تغذیه مواد مغذی به کمک میکروپروسسها و پارامترهای چندی که به عنوان پایه‌ای برای چنین کنترلی استفاده می‌شوند. بنابراین تغییر در ویسکوزیته، pH، میزان مواد مغذی، میزان اکسیژن حل شده و میزان گاز خروجی می‌توانند برای چنین هدفی استفاده شوند.
کشت غیر پیوسته همراه با خوراک‌دهی، باعث زیاد شدن حجم مایع تخمیری در طول مدت تخمیر می‌گردد مگر اینکه مایع از ظرف تخمیر وقتی فرمانتور پر است حذف شود(36).
برای توسعه دادن تخمیر بعد از این زمان، حجم‌های کمی از مایع تخمیری را می‌توان خارج کرد و محصول را در طول مراحل بعدی تخمیر بازیافت نمود. چنین روشهایی را می‌توان همچنین برای روشهای جایگزینی جزئی که محیط کشت خام به فرمانتور، دوباره برای توسعه دادن مدت بهره وری، اضافه می‌شود، استفاده گردد.علاوه بر اضافه کردن حجم و در اینجا مقدار آنتیبیوتیک، هر دو روش مزیت نگهداری میکروارگانیسم در میزان رشد بهینه آن را برای تولید آنتیبیوتیک دارند.
میزان زیاد کف روی محیط کشت، ظرفیت ظرف را کم می‌کند بنابراین کنترل کردن میزان تشکیل کف ضروری است. کنترل کف معمولا یا بوسیله ترکیب عوامل شیمیایی خاص که ضد کف هستند، داخل محیط کشت انجام می‌شود و یا با اضافه کردن چنین موادی در طول مدت تخمیر انجام می‌گردد. زمانی که مشکل کف کردن آشکار می‌گردد به فرایند بستگی دارد. یک مشخصه محیط کشت محتوی پروتئین تمایل آنها به کف کردن، به ویژه در حالت تخمیرهایی که محیط شدیدا هم زده می‌شود و هوادهی می‌گردد، است(12).
ضد کف‌هایی که استفاده می‌شوند یا از نوع غیر قابل متابولیزه شدن هستند مانند سیلیکون‌ها یا قابل متابولیزه شدن هستند مانند روغن‌های گیاهی، که در چنین حالتی آنها را به عنوان گزینه منابع کربن و انرژی نیز بکار گرفته می‌شوند.
همانطور که در تعداد زیادی از ضد کف‌های موجود دیده شده است، ضد کفی که تحت همه شرایط موثر باشد وجود ندارند و ماده مؤثربه طور تجربی مشخص می‌شود در حالی که کنترل کردن تشکیل کف مهم است، هزینه بالای ضد کف‌ها و این حقیقت که آنها تمایل به اکسیژن‌زدایی محیط کشت ( کم کردن میزان اکسیژن محلول ) دارند میزان اضافه کردن ضد کف را دیکته می‌کند. با وجود محدودیت مصرف ضدکف، یک تعداد پروب کف داخل هر فرمانتور وجود دارد و تنها وقتی کف ظاهر می‌شود ضد کف آنقدر داخل فرمانتور اضافه می‌شود که تشکیل کف متوقف گردد(44).
از آنجایی که تشکیل کف نه تنها منجر به هدر رفتن محصولات گرانبها خواهد شد، بلکه همچنین خطر اضافه شدن آلودگی به محتوای موجود در ظرف وجود دارد. مراقبت کردن از اینکه کف تشکیل نشود ضروری است. در موقعیت حساس که تشکیل کف ظاهر می‌شود برای کنترل کردن، پروبهای کف می‌توانند ورودی هوا را قطع کنند، همزن را متوقف کنند و به کارکنان عملیاتی اخطار دهند که اقدام اضطراری نیاز است.
کنترل دقیق دما در بدست آوردن ماکزیمم بهره‌وری در مرحله نهایی مهم است. رشد و بهره‌وری ارگانیسم و پایداری محصول نهایی همگی به دما حساس هستند. دمای بهینه برای رشد و بهره‌وری ممکن است متفاوت باشد. دمای بهینه برای کل فرایند به طور تجربی تعیین می‌شود و برای بیشتر تخمیرهای آنتیبیوتیک بین Cْ 24 و Cْ28 قرار دارد(46).
زمانیکه تولید آنتیبیوتیک دارد متوقف می‌شود، پایداری محصول جمع شده اگر دمای مایع تخمیری کم شود بهبود داده می‌شود و این عمل یا در فرمانتور انجام می‌شود و یا با انتقال مایع تخمیری به یک ظرف جدا، ظرف نگهدارنده ساده تر که پیش سرد شده، انجام می‌گردد. مورد دوم به خاطر اینکه فرمانتور آزاد است تا برای تخمیر بعدی آماده شود، در حالی که مایع تخمیری به دستگاه استخراج تغذیه می‌شود، ترجیح داده می‌شود(31).
1-25-6) تکنولوژی تخمیر آنتیبیوتیک
1-25-6-1) تخمیر شیک فلاسک
تخمیرهای مقیاس کوچک میکروارگانیسم‌های تولید کننده آنتیبیوتیک، معمولا در محیط‌های کشت غوطه‌ور ، داخل فلاسک‌ها انجام می‌شود.
تخمیرهای شیک فلاسک برای موارد زیر استفاده می‌شوند:
برای کشت دادن نمونه‌های خاک در برنامه‌های جداسازی
برای مقایسه کردن ظرفیت تولید گونه‌های جهش داده شده از یک ارگانیسم
برای سنجش تاثیر ترکیبات مختلف محیط کشت روی بهره‌وری
برای فراهم کردن یک مایه تلقیح برای تخمیرهای مقیاس بزرگتر
اکثر آنتی‌بیوتیک‌ها تحت شرایط هوازی بوسیله میکروارگانیسم‌های رشته‌ای تولید می‌شوند. نیازهای عمده برای یک تولید مناسب (در مجموع برای تخمیر ترکیب محیط‌کشت)، تهیه کردن اکسیژن کافی و یک دمای مناسب می‌باشد(45).
هوادهی برای فراهم کردن اکسیژن مورد نیاز بوسیله رشد دادن محیط‌های کشت در یک حجم کوچک محیط کشت، در فلاسک‌های نسبتا بزرگ(برای نمونه، 50 یا ml 100 محیط کشت در فلاسک‌های ml 500) روی یک شیکر چرخنده، که یک حرکت مداری به مایع می‌دهد فراهم می‌شود.
فلاسک‌ها معمولا یک یا چند بافل برای زیاد کردن اغتشاش و در نتیجه انتقال اکسیژن دارند.
فلاسک‌ها باید طوری که تبدیلات گازی انجام شود ولی از ورود میکروارگانیسم‌های آلوده کننده جلوگیری گردد، آب بندی شوند. در گذشته توپی‌های کتانی استفاده می‌شدند. در حال حاضر، سرپوشهای فلزی فیت کننده، توپی‌های پلاستیکی با قابلیت استفاده مجدد، یک تا دو لایه از یک باند استریل و مواد مصنوعی نفوذ‌پذیر معمولا پیشنهاد می‌شوند. دمای دلخواه یا بوسیله قرار دادن شیکرها(که معمولا می‌توانند 50 تا چند 100 فلاسک را حمل کنند) در یک اتاق با دمای کنترل شده و یا قرار دادن در یک انکوباتور با یک واحد کنترل دما، فراهم می‌شود.
یک تغییر در این تکنولوژی، استفاده از شیکرهای رفت و برگشت کننده به جای شیکرهای چرخشی است که در این حالت محیط‌های کشت را می‌توان در لوله‌های آزمایش بزرگ به جای فلاسک‌های ارلن مایر رشد داد (47) .
1-25-6-2) فرمانتورهای همزندار
از آنجایی که با افزایش حجم، نسبت سطح به حجم کاهش می‌یابد ، مبادله هوا ناکافی می‌شود، تخمیرهای شیک فلاسک تنها در مقیاس آزمایشگاهی ترجیح داده می‌شوند. بنابراین تخمیر در حجم‌های از چند لیتر تا چند متر مکعب، در فرمانتورهای همزندار با هوادهی اجباری انجام می‌شود. تکنولوژی فرمانتورهای همزندار اساسا به علت مسئله آلودگی پیچیده‌تر است.
یک فرمانتور، یک ظرف بسته استیلی(گرچه جنس شیشه‌ای نیز می‌تواند برای فرمانتورهای تا حجم 10 لیتر استفاده شود)، فیت شده با یک وسیله همزننده، هوادهی اجباری و یک سیستم کنترل دما است. بعلاوه برای تغذیه، خروجی‌هایی برای نمونه گیری، برداشت محصول یا تخلیه کردن و نگهدارنده‌های پروب برای کنترل کردن دستگاه در نظر گرفته شده است(47).
1-25-7) تاثیر دما بر فرایند تخمیر آنتیبیوتیک
میکروارگانیسم‌ها راکتورهای هتروژن کوچک هستند که چندین واکنش و عملیات انتقال و تولید صدها محصول را در داخل یک ساختاری که به شکل منظمی سازماندهی شده انجام می‌دهند. دما هریک از موارد بالا را تحت تاثیر قرار می‌دهد و می‌تواند فرایند تخمیر را در مسیرهای خیلی پیچیده و اغلب ناشناخته تحت تاثیر قرار دهد. افزایش دما همچنین حلالیت اکسیژن و دی اکسید کربن را کاهش می‌دهد و این می‌تواند فرایند تخمیر را تحت تاثیر قرار دهد(46).
در این بخش ما به طور جزئی از اثراتی که دما می‌تواند روی تخمیرها داشته باشد و اهمیت آنها در بزرگنمایی کردن فرایند را بحث خواهیم کرد.
بطور کلی میکروبها فقط می‌توانند سرتاسر یک رنج دمایی محدودی رشد کنند.
سرعت رشد بصورت تابعی از دما برای یک ارگانیسم مزوفیلیک نمونه استرپتومایستها در این طبقه از ارگانیسم‌ها قرار دارند.
سرعت رشد در انتهای پایینی رنج دما، پایین است و به تدریج برای رسیدن به یک پیک دمای رشد، افزایش می‌یابد و بعد از آن به سرعت، رشد کاهش پیدا می‌کند(18).
باکتریها عموما برای رشد بهینه داخل چهار محدوده دمایی طبقه بندی می‌شوند. بطور کلی استرپتومایستها داخل رنج پایین‌تر مزوفیل‌ها قرار می‌گیرند که دارای دمای بهینه رشد در رنج Cْ 25 تا Cْ 35 است. بیشتر تخمیرهای استرپتومایسس در دماهای بالا بین Cْ27 و Cْ34 برای بدست آوردن بهره‌وریهای ماکزیمم دما انجام می‌شوند(26).
توجه کردن به این نکته مهم است که سرعت تولید آنتیبیوتیک غالبا با دما افزایش می‌یابد اما توانایی برای حفظ کردن سرعت بهینه تولید برای مدت زمان وسیع غالبا با افزایش دما، کاهش می‌یابد.
جدول (1-6): محدوده بهینه دما برای گروههای باکتریایی
( Cْ0 ) دمای رشد
گروه
ماکزیمم
بهینه
می نیمم
22 – 19
18 – 15
5 >
Obligate psychrophiles
35 – 30
30 – 25
5
Facutitative psychrophiles
47 – 35
45 – 30
15 – 10
Mesophiles
85 – 60
75 – 55
45 – 40
Thermophiles
Farrell و Rase (1967) یک تعداد از اثرات بالقوه که افزایش دما می‌تواند روی متابولیسم میکروبی داشته باشد را بحث کرده‌اند. یک جمع بندی جزئی از این اثرات در زیر آورده شده است:
غیرفعال سازی یک آنزیم محدود‌کننده
غیرفعال سازی عمومی پروتئین‌های متعدد
افزایش مرگ یا نرخ بقاء
تجزیه غشاء‌ها
تجزیه تنظیم کننده‌های متابولیک
افزایش خطا در کدکردن برای ماکرومولکولها
تغییرات در ساختار پروتئین
تغییرات در معماری مولکولی غشاء سیتوپلاسمیک
تولید یا تجمع مواد سمی
وقتی پیچیدگی اثرات دما در نظر گرفته شود، بدیهی می‌باشد که انتخاب و کنترل بهتر دما یک فاکتور ضروری در بزرگنمایی کردن و بهینه کردن تخمیرهای استرپتومایسس می‌باشد(24).
1-25-7-1) انتقال حرارت و کنترل دما
حرارت عموما از فرمانتورها بوسیله حرکت دادن آب سرد در عرض سطح انتقال حرارت که در تماس با مایع تخمیری است، حذف می‌شود. وسایل انتقال حرارت نمونه برای فرمانتورها عبارتند از:
ژاکتها، کویلهای داخلی، کویلهای نیم لوله‌ای بیرونی،
