تحقیق درباره دقيقه، ميليليتر، ميلي، اسيد

دانلود پایان نامه ارشد

20 درصد كه حاوي 5/0 درصد اسيد تيوباربيتوريك بود، اضافه شد. مخلوط حاصل به مدت 30 دقيقه در دماي C?95 حمام آب گرم حرارت داده شد. سپس بلافاصله در حمام يخ سرد گرديد و مجددأ به مدت 10 دقيقه در 10000دور در دقيقه سانتريفوژ شد. ميزان جذب نمونهها در طول موج 532 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، اندازهگيري شدند. ماده مورد نظر براي جذب در اين طول موج كمپلكس قرمز رنگ MDA-TBA است. جذب ساير رنگيزههاي غيراختصاصي در 600 نانومتر تعيين و از اين مقدار كسر شد. براي محاسبه غلظت مالونديآلدئيد از ضريب خاموشي معادل mM-1cm-1 155 استفاده شد و نتايج حاصل از اندازهگيري بر حسب نانومول بر گرم وزن‌تر محاسبه شد [Heath and Packer, 1969].
2-7-4-2-سنجش ساير آلدئيدها (پروپانال، بوتانال، هگزانال، هپتانال و پروپانال دي متيل استال)
2/0 گرم از بافت تازه برگي از برگهاي شاخه اصلي (برگهاي توسعه يافته از گرههاي 4 و 5) در پايان آزمايش در هاون چيني حاوي 5 ميليليتر تريكلرواستيك اسيد 1/0 درصد سائيده شد. عصاره حاصل با استفاده از دستگاه سانتريفوژ به مدت 5 دقيقه در 10000 دور در دقيقه سانتريفوژ شد. به يك ميليليتر از محلول رويي حاصل از سانتريفوژ، 5 ميليليتر محلول تريكلرواستيك اسيد 20 درصد كه حاوي 5/0 درصد اسيد تيوباربيتوريك بود، اضافه شد. مخلوط حاصل به مدت 30 دقيقه در دماي C?95 حمام آب گرم حرارت داده شد. سپس بلافاصله در حمام يخ سرد گرديد و مجددأ به مدت 10 دقيقه در 10000دور در دقيقه سانتريفوژ شد. ميزان جذب نمونهها در طول موج 455 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، اندازهگيري شدند. جذب ساير رنگيزههاي غيراختصاصي در 600 نانومتر خوانده و از اين مقدار كسر گرديد. براي محاسبه غلظت ساير آلدئيدها از ضريب خاموشي معادل mM-1cm-1105×457/0 استفاده شد. اين ضريب خاموشي ميانگين ضريب خاموشي براي آلدئيدهاي مورد نظر است [Meirs et al, 1992].
2-7-5-پراكسيد هيدروژن
5/0 گرم از بافت تازه برگ از برگهاي شاخه اصلي (برگهاي توسعه يافته از گرههاي 4 و 5) در پايان آزمايش در هاون چيني حاوي تريكلرواستيك اسيد 1/0 درصد سرد سائيده شد. عصاره حاصل به مدت 15 دقيقه با استفاده از دستگاه سانتريفوژ يخچالدار به مدت 5 دقيقه در 10000 دور در دقيقه سانتريفوژ شد. سپس به 500 ميکرو ليتر از محلول رويي، 500 ميکرو ليتر بافر فسفات پتاسيم 100 ميليمولار (7=pH) و 2 ميليليتر يديد پتاسيم 1 مولار اضافه شد. مخلوط واكنش به مدت 1 ساعت در تاريكي در دماي اتاق قرار داده شد. ميزان جذب نمونهها در طول موج 390 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، اندازهگيري شدند. غلظت پراكسيد هيدروژن با استفاده از ضريب خاموشي معادل1 M-1cm-28/0 محاسبه و بر حسب ميکروگرم در گرم وزن تر گياهي محاسبه شد [Veilkova et al., 2000].
2-7-6-پروتئين محلول کل و سنجش فعاليت آنزيمها
2-7-6-1-تهيه بافر استخراج
تهيه بافر فسفات 50 ميلي مولار با pH برابر 7 به‌صورت زير مي‌باشد:
1- 68/0گرم نمک پتاسيم دي هيدروژن فسفات (KH2PO4) به همراه 2 گرم PVPP و Na-EDTA در 50 ميلي‌ليتر آب مقطر حل شدند و حجم آن به 100 ميلي ليتر رسانده شد.
2- 87/0گرم نمک پتاسيم مونوهيدروژن فسفات (K2HPO4) به همراه 2 گرم PVPP و Na-EDTA در 50 ميلي‌ليتر آب مقطر حل شدند و حجم آن به100 ميلي‌ليتر رسانده شد.
3- محلولهاي 1 و2 به عنوان محلولهاي ذخيره بودند که در هر بار آزمايش 39 ميلي‌ليتر از محلول 1 با 61 ميلي‌ليتر از محلول 2 مخلوط شده و pH آن با استفاده از pH‌ متر بين2/7-8/6 تنظيم ميشد.
2-7-6-2-مرحله استخراج
بهمنظور استخراج و اندازه‌گيري پروتئين محلول کل و آنزيم‌ها، برگ‌هاي فريز شده در هاون چيني ريخته و نيتروژن مايع به آن اضافه شد. سپس برگ‌ها بهخوبي كوبيده شده تا كاملاً خرد شوند. 5/0 گرم از پودر برگ آسياب‌شده به ميكروتيوب‌هاي 2 ميلي‌ليتري منتقل شدند و يك ميليليتر از بافر استخراج به آن اضافه و به مدت 30 ثانيه ورتکس شدند. سپس به مدت 15 دقيقه با 14000 دور در دقيقه در دماي 4 درجه سانتي‌گراد، سانتريفوژ شدند. پس از اتمام سانتريفوژ عصارههاي رويي با استفاده از سمپلر برداشته شدند و به ميكروتيوب‌هاي 5/1 ميلي‌ليتري منتقل شدند و دوباره به مدت 10 دقيقه با 14000 دور در دقيقه در دماي 4 درجه سانتي‌گراد، سانتريفوژ شدند. پس از اتمام سانتريفوژ، عصارههاي رويي با استفاده از سمپلر برداشته و به ميكروتيوب‌هايي با همان حجم منتقل شدند. ميكروتيوب‌هاي حاوي عصارهها در زمان سايش برگ‌ها و سانتريفوژ نمونه‌هاي ديگر در داخل ظرف يخ نگهداري شدند و در صورت عدم استفاده به فريزر80- درجه سانتي‌گراد انتقال داده شدند [Beauchamp and Fridovich, 1971]. از اين عصارهها براي سنجش محتواي پروتئين محلول کل و آنزيمهاي پراکسيداز، آسكورباتپراكسيداز وکاتالاز استفاده شد.
2-7-6-3-پروتئين محلول کل
2-7-6-3-1-تهيه بافرهاي سنجش
1) معرف بردفورد: 100 ميليگرم کوماس بلوجي 250 را با 50 ميلي ليتر اتانول خالص مخلوط و به حجم 800 ميليليتر رسانده شد. سپس محلول به دست آمده از صافي عبور داده شد و حجم محلول صاف شده با 100 ميليليتر اسيد فسفريک خالص و آب مقطر به 1000 ميليليتر رسانده شد.
2) محلول استاندارد: 5 ميليگرم آلبومين گاوي در 1 ميليليتر بافر استخراج حل شد. سپس محلول حاصل به هم زده شد و در آب يخ قرار داده شد. سپس به ترتيب طبق جدول زير، مقادير فوق از محلول استاندارد و معرف بردفورد برداشته شد و با يکديگر مخلوط شدند.
جدول 2-6-مقادير برداشته شده از محلول استاندارد و بردفورد به منظور تهيه جدول استاندارد بر حسب ميکروگرم در ميليليتر
600
450
300
150
60
30
12
محلول BSA (µl/3Ml)
1000
750
500
250
100
50
20
برابر با BSA (µg/Ml)
2400
2550
2700
2850
2940
2970
2988
ميزان محلول بردفورد (ميکروليتر)
2-7-6-3-2-تعيين محتواي پروتئين محلول کل
50 ميکروليتر از محلول عصاره رويي حاصل برداشته شد و 2950 ميکروليتر از معرف بردفورد به آن اضافه شد. سپس ميزان جذب نمونههاي عصاره و استاندارد پس از 15 دقيقه در طول موج 595 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، اندازهگيري شدند [Bradford, 1976].

شکل 2-4- منحني و معادله استاندارد پروتئين
2-7-6-4- آنزيم پراکسيداز (POD)
2-7-6-4-1-تهيه بافرهاي سنجش
1) بافر آب اکسيژنه (H2O2) 225 ميلي مولار: براي اين منظور 450 ميکرو ليتر H2O2 با بافر فسفات به حجم 20 ميلي‌ليتر رسانده شد. محلول‌ها به عنوان سوبسترا بايد در هر بار اندازه‌گيري تازه باشند.
2) بافر گاياکول 45 ميلي مولار: براي اين منظور 112 ميکروليتر گاياکول با بافر فسفات به حجم 20 ميليليتر رسانده شد.
2-7-6-4-2-تعيين فعاليت آنزيم
بافر H2O2 به مقدار 495 ميکروليتر و بافر گاياکول به همان مقدار در دماي پايين (ظرف حاوي يخ) با هم مخلوط شدند و به آنها 10 ميکروليتر عصاره آنزيمي اضافه و سپس ميزان جذب در طول موج 470 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، اندازهگيري شد. در محلول بلانک به جاي عصاره آنزيمي، 10 ميکروليتر از بافر فسفات 50 ميلي مولار (7 pH=) استفاده شد. فعاليت آنزيمي با استفاده از فرمول قانون بير لامبرت و ضريب خاموشي گاياکول پراکسيداز (µM-1c-1m6/26)، محاسبه و فعاليت آنزيم در نهايت بر حسب µmol/g FW.min محاسبه شد [Cesar et al., 2010].
2-7-6-5-آنزيم آسكوربات پراكسيداز (APX)
2-7-6-5-1-تهيه بافرهاي سنجش
1) محلول بافر فسفات 25 ميليمولار و با pH برابر 7.
2) بافر اندازه‌گيري: اين بافر حاوي بافر پتاسيم فسفات، EDTA 1/0 ميليمولار، آسکوربيک اسيد 5/0 ميلي‌مولار و H2O2 10 ميلي‌مولار است.
2-7-6-5-2-تعيين فعاليت آنزيم
سنجش فعاليت آنزيم از طريق اندازه‌گيري اکسيد شدن آسکوربات توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، در طول موج 290 نانومتر براي مدت زمان 1 دقيقه انجام شد. براي اين منظور ابتدا نمونه بلانک (با حجم نيم ميلي‌ليتر) حاوي 490 ميكروليتر از بافر شماره 2 و 10 ميکروليتر بافرفسفات، نمونههاي عصاره (با حجم نيم ميلي‌ليتر) حاوي 490 ميكروليتر از بافر شماره 2 و 10 ميكروليتر از عصاره آنزيمي تهيه شد و پس از بهمزدن (يعني با گذاشتن پارافيلم بر روي کووت) سرعت واكنش آنزيمي به‌صورت تغييرات جذب بر زمان (OD/min) در طول موج nm290 براي 1 دقيقه ثبت شد. فعاليت آنزيمي با ضريب خاموشي mM-1cm-18/2 محاسبه شد [Nakano and Asada, 1981].
2-7-6-6-آنزيم کاتالاز (CAT)
2-7-6-6-1-تهيه بافرهاي سنجش
محلول بافر فسفات 25 ميليمولار و با pH برابر 7
بافر اندازه‌گيري: اين بافر حاوي بافر پتاسيم فسفات، EDTA 1/0 ميليمولار و H2O2 10 ميلي مولار است.
2-7-6-6-2-تعيين فعاليت آنزيم CAT
سنجش فعاليت آنزيم کاتالاز از طريق اندازه‌گيري تجزيه آب اکسيژنه توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، در طول موج 240 نانومتر براي مدت زمان 1 دقيقه انجام شد. براي اين منظور ابتدا نمونه بلانک (با حجم نيم ميلي‌ليتر) حاوي 495 ميكروليتر از بافر شماره 2 و 5 ميکروليتر بافر فسفات، نمونههاي عصاره (با حجم نيم ميلي‌ليتر)، حاوي 495 ميكروليتر از بافر شماره 2 و 5 ميكروليتر از عصاره آنزيمي تهيه شد و پس از بهمزدن (يعني با گذاشتن پارافيلم بر روي کووت) سرعت واكنش آنزيمي به‌صورت تغييرات جذب بر زمان (OD/min)، در طول موج nm240 براي 1 دقيقه ثبت شد. فعاليت آنزيمي با ضريب خاموشي µM-1c-1m40 محاسبه شد [Chance and Maehly, 1955].
2-8- عناصر معدني ريشه و برگ
2-8- 1- تهيه خاکستر
به منظور انداره گيري عناصر غذايي، پس از اتمام دوره آزمايش، برگها و ريشهها جدا شدند و پس از شستشوي دقيق، به مدت 48 ساعت در آون با دماي 75 درجه سانتي گراد قرار داده شدند. پس از خشك شدن برگها، نمونهها با آسياب برقي به صورت پودر در آورده شدند. پس از تهيه خاكستر از مواد گياهي در دماي 550 درجه سانتي گراد، عصاره گيري با استفاده از 10 ميلي ليتر كلريدريك اسيد 2 نرمال و آب مقطر و رساندن به حجم 50 ميلي ليتر انجام شد ]امامي، 1375[.
2-8-2-نيتروژن
25/0 گرم از نمونه گياهي ريشه و برگ که به صورت کاملا يکنواخت پودر شده بود، در تيوپ شيشه اي مخصوص ريخته شد و 10 ميلي ليتر اسيد سولفوساليسليک (50 گرم اسيد ساليسيليک + يک ليتر اسيد سولفوريک) + دو گرم کاتاليزور (100 گرم سولفات پتاسيم + 10 گرم سولفات مس + يک گرم سلنيوم) + 20 ميلي ليتر آب مقطر به آن اضافه شد. محلولها به مدت سه ساعت در دماي 420 درجه حرارت داده شدند تا در کف شيشهها، عصاره سبز رنگي باقي بماند که نشانه آماده شدن عصاره به منظور تيتراسيون بود.
سپس به هر يک از تيوپهاي شيشهاي، حدود 20 ميلي ليتر آب مقطر اضافه شد و تقطير و تيتراسيون با دستگاه تمام اتوماتيک کجلدال انجام گرفت و مقدار نيتروژن موجود در برگ و ريشه طبق فرمول زير (2-12)، بر حسب گرم درصد بيان شد ]امامي، 1375[.
B=1.401*m*v1/w*c*v2 (2-12)
که در آن:
M: مولاريته اسيد
C: ظرفيت اسيد
W: وزن نمونه گياه جهت هضم بر حسب گرم
V1: حجم عصاره نهايي از مرحله هضم بر حسب ميليليتر
V2: حجم عصاره مورد استفاده جهت عمل تقطير
2-8-3-پتاسيم
2-8-3-1- آماده کردن محلول‌هاي سنجش
1) محلول کلروسزيم با غلظت 87/0 گرم در ليتر: 1/1 گرم کلروسزيم صددرصد خاص در بالن ژوژه يک ليتري ريخته شد و با افزودن آب مقطر به حجم يک ليتر رسانده شد.
2) محلول استاندارد غليظ پتاسيم به غلظت 5000 ميلي گرم در ليتر (1): مقدار 534/9 گرم کلرور پتاسيم خشک شده در دماي 105 درجه سانتيگراد در آون را در بالن ژوژه‌ي يک ليتري ريخته شد و با استفاده از آب مقطر به حجم يک ليتر رسانده شد.
3) محلول استاندارد پتاسيم 500 ميليگرم در ليتر (2): 100 ميليليتر از محلول استاندارد بالا در بالن ژوژه يک ليتري ريخته شد و با

پایان نامه
Previous Entries تحقیق درباره ميليليتر، دقيقه، استاندارد، ميزان Next Entries تحقیق درباره استاندارد، ميليليتر، ريخته، ]امامي،