تحقیق درباره بیوتکنولوژی، مواد معدنی، زیست محیطی

دانلود پایان نامه ارشد

باشد به آن کروماتوگرافی مایع ـ مایع LLC  (HPLC) گویند و در نهایت اگر فاز متحرک، گاز و فاز ثابت، مایع باشد، به آن کروماتوگرافی گاز- مایع GLC (یا VPC) گویند. در LSC، جدا شدن بر اساس جذب سطحی یا تعریض یون‌ها و یا تشکیل کمپلکس می‌باشد. در GSC اساس، جداسازی جذب سطحی است. در LLC و GLC، مواد بر اساس توزیع بین دو فاز جدا می‌شوند. پس کروماتوگرافی روشی برای جداسازی مخلوط بدلیل اختلاف تحرک آنها می‌باشد. کروماتوگرافی LSC در واقع نوعی کروماتوموگرافی جذبی است که مواد بر اساس اختلاف در قابلیت جذب خود روی سطح جامد از یکدیگر جدا می‌شوند. در GSC نیز اساس جداسازی جذب سطحی فاز گاز روی سطح جامد است. از این روش برای خالص سازی گازها استفاده می‌شود(66).
از میان تکنیک‌های جداسازی، کروماتوگرافی ‌مایع با کارایی‌بالا (High Performance Liquid Chromatography)یا (HPLC )، بیشترین رشد و کارایی را داشته است و سالیانه میلیونها دلار صرف خرید و فروش دستگاههای HPLC در دنیا می‌شود. علت این رشد را می‌توان به موارد زیر نسبت داد:
حساسیت بالا
تعیین مقدار کمی با صحت بالا
قابلیت آنالیز نمونه‌های غیرفرار و حساس به دما که با تکنیک GC (کروماتوگرافی گازی) امکانپذیر نیستند
کاربرد گسترده آن برای مواد پراهمیت
زمینه‌های مختلف علوم و جامعه
در صنعت پیش از دهه ۱۹۷۰ روشهای بسیار‌کم و غیر قابل اعتمادی جهت کروماتوگرافی در آزمایشگاههای دانشمندان وجود داشت.
در طول دهه ۱۹۷۰ بیشتر جداسازی مواد شیمیایی توسط روشهای متعددی انجام می‌شده که شامل کروماتوگرافی ستونی، کروماتوگرافی کاغذی و کروماتوگرافی لایه نازک بوده است. بهر حال این تکنیکهای کروماتوگرافی جهت شناسایی و تعین غلظت بین مواد مشابه و یکسان کافی نبود(60).
در این حین استفاده از روش کروماتوگرافی مایع تحت فشار برای کاهش زمان جداسازی رواج پیدا کرد و کاهش زمان خالص سازی ترکیبات بروش روماتوگرافی ستونی انجام شد. به هر حال شدت جریان مایع درون این ستون ثابت و پایدار نبود و مدتها این سوال مطرح بوده که بهتر نیست این شدت جریان یا فشار ثابت باشد ؟
توسعه کروماتوگرافی مایع با فشار بالا در اواسط دهه ۱۹۷۰ انجام شد و پیشرفت و تکامل آن مقارن شد با تکامل مواد پک شده درون ستون کروماتوگرافی و همچنین ردیابهای اتوماتیکی که می‌توانستند بصورت آنلاین مقدار عبور مایع را محاسبه نمایند.
در اواخر دهه ۱۹۷۰، روشهای جدیدی شامل کروماتوگرافی مایع با فاز معکوس این امکان را فراهم کرد تا جداسازی ترکیبات بسیار مشابه، عملی گردد. در دهه ۱۹۸۰، بطور رایجتری از HPLC  برای جداسازی ترکیبات شیمیایی استفاده می‌شده است.
تکنیکهای جدید روشهای جداسازی، شناسایی، خالص‌سازی و محاسبه مقدار را متفاوت از گذشته توسعه داد. همچنین برای تسهیل در کار HPLC ، کامپیوتر و اتوماسیون به سایر روشها اضافه گردید.
به مرور تکامل انواع ستونها، تولید ستونهای بسیار باریک، ستونهای پیوسته باعث سرعت در کار HPLC  گردید. در دهه گذشته شاهد ظهور میکرو‌ستونها و ستونهای تخصصی شده برای  HPLC  بوده‌ایم. قطر معمول میکروستونها یا ستونهای مویی شکل، حدود µm  ۳  تا   µm  ۲۰۰ دارد.
طول ستونهای HPLC  سریع،  کمتر از ستونهای HPLC  معمولی و برابر mm  ۳  است و در بخشهای بسیار کوچک در دستگاه HPLC  جاسازی می‌گردند. هر چند که امروزه HPLC  مورد توجه تحقیقات بیوتکنولوژیکی، شیمیایی و بیوشیمیایی و همچنین صنایع داروسازی است اما این موارد فقط ۵۰ درصد  استفاده کنندگان HPLC  را نشان می‌دهد. در حال حاضر از HPLC  در صنایع آرایشی، غذایی، تولید انرژی و صنایع زیست محیطی استفاده می‌شود.

3-8-1-2) فاز ساکن و فاز متحرک 
در مورد قطبیت فاز‌های ساکن و متحرک یک قاعده کلی وجود دارد. طبق این قاعده، قطبیت حل‌ شونده و فاز متحرک باید نزدیک به هم باشد ولی با فاز ساکن اختلاف داشته باشد. عموما فاز متحرک حاوی مخلوطی از حلالهای قطبی نظیر الکل و غیر قطبی نظیرهیدروکربنها است. با کنترل ترکیب و قطبیت فاز متحرک در روش گرادیان حلال می‌توان زمان و حجم باز داری مواد را در ستون HPLC  کنترل نمود. فاز متحرک در HPLC  باید چنان انتخاب شود که در آشکار ساز مزاحمت ایجاد نکند. معمولا مخلوطهای متانول, اتانول یا پروپانول با هپتان و کلروفرم با هپتان را به عنوان فاز متحرک در HPLC  مورد‌استفاده قرار می‌دهند. در HPLC  فاز معکوس عموما از مخلوط متانول یا استونیتریل با آب به عنوان فاز متحرک استفاده می‌شود.
ترتیب قطبیت گروه‌های عاملی در ترکیبات به صورت زیر است:

هیدروکربن اترها استرها کتون‌ها آلدئیدها آمیدها آمین‌ها الکل‌ها

خصوصیات فاز متحرک در HPLC  در زیر آمده است:
درصد خلوص بالا ( حلالهایی با درصد خلوص بسیار بالا ، HPLC  Grade، در بازار موجود است که قیمت بالایی نیز دارد)
نقطه جوش بالاتر از دمای ستون ( به خصوص در مواردی که با گرمکن (Oven) کار می‌شود)
واکنش پذیری کم (Inertness)
قابلیت تطابق با آشکارساز 
شکل زیر نمایی از یک دستگاه HPLC را به همراه اجزاء مختلف آن به تصویر کشیده است:

شکل(3-7): نمایی از دستگاهHPLC

3-8-1-3) اطلاعات حاصل از یک کروماتوگرام
یک نمونه کروماتوگرام در شکل(3-8) نشان داده شده است که در آن سه نوع قند از یکدیگر جدا شده‌اند. اطلاعات کمی، نیمه کمی و کیفی از ولتاموگرام قابل استخراج است.
شکل (3-8): نمونه‌ای از یک کروماتوگرام
3-8-1-4) کاربردهای کیفی:
آنالیز کیفی، برای تشخیص و شناسایی نوع ترکیبات انجام می‌شود. از آنجایی که زمان بازداری (Retention Time) برای هر ماده در یک سیستم و شرایط خاص آزمایشگاهی ثابت و مشخص می‌باشد، می‌توان از آن جهت تعیین نوع آنالیت استفاده کرد. به این منظور کروماتوگرام آنالیت را با کروماتوگرام به دست آمده از استاندارد آن آنالیت مقایسه می‌کنند. در صورت یکسان بودن زمان بازداری می‌توان با قطعیت نوع ماده را تعیین کرد. ذکر این نکته لازم است که مقایسه این دو کروماتوگرام تنها در شرایط آزمایشگاهی و دستگاهی کاملاً یکسان معتبر است. 

3-8-1-5) آنالیزکمی:
به منظور تعیین کمی مقدار آنالیت، سطح زیر پیک و یا ارتفاع پیک ترکیب مجهول را با نمونه استاندارد مقایسه می‌کنند. در مواردی که پیک ها باریک و متقارن باشند، اندازه گیری ارتفاع پیک از صحت و سرعت بیشتری برخوردار است. هر چند که امروزه به راحتی می‌توان ارتفاع و سطح زیر پیک را به کمک دستگاه های الکترونیک با دقت و صحت بالایی محاسبه کرد. روشهای مختلفی جهت محاسبه مقدار مجهول وجود دارد که در ادامه به برخی از این روشها اشاره می شود:

3-8-1-5-1) روش استاندارد خارجی (External Standard):
 در این روش، محلول‌هایی با غلظت‌های مختلف از استاندارد (استاندارد آنالیت مورد نظر) ساخته شده و سپس بر اساس ارتفاع یا سطح زیر پیک بدست آمده از کروماتوگرام این استانداردها، منحنی کالیبراسیون ( منحنی ارتفاع و یا سطح زیر پیک، بر حسب غلظت) رسم می‌شود. با استفاده از معادله خط بدست آمده، مقدار ارتفاع و یا سطح زیر پیک نمونه مجهول، مقدار دقیق آنالیت محاسبه می‌شود.

3-8-1-5-2) روش افزایش استاندارد (Standard Addition):
 در این روش ابتدا ماده مجهول، آنالیز می‌شود، سپس به چند ظرف که حاوی مقدار یکسانی از نمونه است، حجم‎های مشخصی از استاندارد اضافه می‌شود و کروماتوگرام مربوط به هر مرحله را آنالیز و در نهایت ارتفاع یا سطح زیر پیک نمونه ها را بر اساس حجم استاندارد اضافه شده رسم می‌کنند. در نهایت با استفاده از روابط موجود می‌توان غلظت نمونه را محاسبه کرد. استفاده از این روش سبب حفظ بافت و ماتریس نمونه ها می‌شود در نتیجه با این روش احتمال مزاحمت بافت (Matrix Interference) نمونه از بین برده می‌شود .

3-8-1-5-3) استاندارد داخلی (Internal Standard):
 دو نوع خطا (سیستماتیک و تصادفی) در سیستم موجود است. برخی از این منابع ثابت را می‌توان با اضافه کردن یک استاندارد داخلی به نمونه‌ها و تقسیم ارتفاع پیک یا سطح زیر پیک مربوط به هر آنالیت بر همین مقادیر مربوط به استاندارد داخلی، حذف کرد. در انتخاب استاندارد داخلی باید به شباهت‌های ساختاری آنالیت با جزء انتخابی، نزدیک بودن زمان بازداری پیک آن به پیک نمونه و .. توجه کرد. با انتخاب یک استاندارد داخلی مناسب می‌توان خطا را از 1 تا 2 درصد به 5/0 تا 1 درصد کاهش داد.
3-8-1-6) نتیجه‌گیری:
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا، روشی مناسب جهت جداسازی، اندازه گیری، و تعیین نوع مواد است. این تکنیک با تلفیق با روشهای دیگر و آشکارسازهای پیشرفته‌ای مانند طیف سنج جرمی کاربرد‌های زیادی در علوم مختلف دارد. انتخاب فاز متحرک و ثابت، انتخاب آشکارساز و تعیین سرعت جریان فاز متحرک از جمله موارد اساسی در تنظیمات یک روش مناسب HPLC است.

3-8-2) روش TLC (Thin Layer Chromatography )
کروماتوگرافی با لایه نازک نوعی از کروماتوگرافی جذب سطحی است که در این روش از صفحات با ضخامت نازک استفاده می‌شود و موقعیت اجزای جدا شده روی صفحه مشخص می‌گردد. ذرات روی لایه باید تراکم زیادی داشته باشند و همسان و کوچک باشند. قائم ساکن اغلب از جنس سلولز است که برای جدا سازی مولکول‌های هیدروفیلی مثل هیدرات‌های کربن ، اسیدهای آمینه ، مشتقات اسید نوکلئیک ومواد معدنی استفاده می‌شود. 
3-8-2-1) سیر تحولی و رشد 
در سال 1938 ایزومیلو و شرایبده استفاده از یک جاذب کروماتوگرافی به شکل یک لایه نازک تثبیت شده بر روی یک تکیه‌گاه محکم و بی‌اثر را پیشنهاد کرده‌اند و در سال 1951 شنر ، میلر ، و کلر ، ترپن‌ها را بر روی یک «نوار کروماتوگرافی» جدا کردند. این نوار از یک باریکه کوچک شیشه‌ای با جاذب مخلوط با نشاسته یا گچ شکسته‌بندی، که به عنوان چسباننده عمل می‌کند، پوشیده شده بود. طرز به کار بردن باریکه‌ها مانند روش به کار بردن کاغذ کروماتوگرافی کاغذی بود و در واقع هدف اولیه استفاده از روش لایه نازک به کار بردن روش‌های کروماتوگرافی تقسیمی و کاغذی در یک سیستم جذب سطحی بوده است. در اواخر دهه 1950 استال، روش‌های ساده‌ای را برای تهیه صفحات اختراع کرد و نشان داد که کروماتوگرافی لایه نازک می‌تواند برای بسیاری از جداسازی‌ها به کار رود. 
3-8-2-2) کروماتوگرافی لایه نازک (TLC)
کروماتوگرافی لایه نازک نوعی کروماتوگرافی جذبی جامد – مایع است و اصول آن مانند کروماتوگرافی ستونی است. ولی در این مورد جسم جاذب جامد را به صورت یک لایه نازک در روی یک قطعه شیشه یا پلاستیک محکم پخش می‌کنند. یک قطره از محلول نمونه یا مجهول را در نزدیکی لبه صفحه می‌گذارند و صفحه را همراه مقدار کافی از حلال استخراج کننده در ظرفی قرار می‌دهند. مقدار حلال باید آنقدر باشد که فقط به سطح زیر لکه برسد (شکل الف). حلال به طرف بالای صفحه میرود و اجزاء مخلوط را با سرعتهای متفاوت با خود می‌برد. در نتیجه ممکن است تعدادی لکه روی صفحه ظاهر شود. این لکه ها روی یک خط عمود بر سطح حلال ظرف قرار میگیرند (شکل ب).
این روش کروماتوگرافی بسیار آسان است و به سرعت هم انجام می‌شود. این روش برای تفکیک اجزاء یک مخلوط بسیار مفید است و همچنین می‌توان از آن برای تعیین بهترین حلال استخراج کننده جهت کروماتوگرافی ستونی استفاده کرد.
در TLC می‌توان از همان مواد جامد که در کروماتوگرافی  ستونی استفاده می‌شود استفاده کرد و در این میان سیلیکا و آلومینا بیشتر به کار می‌رود. معمولا جسم جاذب را با مقدار کمی از ماده نگهدارنده مانند گچ شکسته بندی، کلسیم سولفات و یا نشاسته مخلوط می‌کنند تا جسم جاذب چسبندگی لازم را پیدا کند و به صفحه بچسبد. صفحه‌ها را میتوان قبل از مصرف تهیه کرد و یا از ورقه های پلاستیکی آماده که در بازار موجود است استفاده نمود.
یکی از مزایای مشخص TLC آن است که احتیاج به مقدار بسیار کمی از نمونه دارد. در بعضی مواد می‌توان تا مقدار 9-10 گرم را تشخیص داد. اما ممکن است اندازه نمونه تا 500 میکرو گرم برسد. در نمونه‌های زیاد می‌توان از

پایان نامه
Previous Entries تحقیق درباره نام گذاری Next Entries تحقیق درباره استاندارد سازی، قابلیت اندازه گیری، رواناب شهری، زیست محیطی