ن از تجربه‌های تهیه‌ای استفاده کرد. در این تجربه‌ها لکه‌های مختلف را می‌تراشند و با یک حلال مناسب می‌شویند (استخراج می‌کنند). و برای شناسایی (از طریق طیف سنجی) به کار می‌برند.
تشخیص لکه‌های رنگین در روی کروماتوگرام آسان است و برای تعیین محل لکه‌های اجسام بی‌رنگ روشهای متعددی وجود دارد. برای مثال میتوان با تابش نور ماوراء بنفش به صفحه محل لکه، ترکیبهایی را که خاصیت فلوئورسانس دارند مشخص کرد. به روش دیگر میتوان جسم جاذب را با ماده فلوئورسانس‌دار بی‌اثر دیگری مخلوط کرد. هنگامی که نور ماوراء بنفش به این صفحه بتابد، لکه اجسامی که نور ماورای بنفش را جذب می‌کنند ولی خاصیت فلوئورسانس ندارند در زمینه فلورسانس‌دار صفحه به صورت تیره رنگ ظاهر می‌شوند. در بسیاری موارد دیگر، از معرفهای آشکارساز دیگری استفاده می‌کنند. این معرفها را میتوان بر روی کروماتوگرام پاشید و لکه ها را ظاهر کرد. سولفوریک اسید، که بسیاری از ترکیبات آلی را به ذغال تبدیل می‌کند و محلول پتاسیم پرمنگنات نمونه‌هایی از معرفهای آشکار ساز هستند که به این روش مصرف می‌شوند. ید نیز معرف آشکار ساز دیگری است که مصرف می‌شود. در این مورد صفحه را در ظرفی می‌گذارند که محیط آن از بخار ید اشباع باشد. بسیاری از ترکیبات آلی ید را جذب می‌کنند و لکه آنها روی کروماتوگرام رنگین (معمولا قهوه ای) می‌شود.
در شرایط معین سرعت حرکت ترکیب نسبت به سرعت پیشرفت حلال (Rf) خاصیت مشخصی از ترکیب است. برای تعیین این مقدار مسافتی را که جسم از خط شروع تا وسط لکه را طی کرده‌است اندازه می‌گیرند و آنرا به مسافتی که حلال پیموده تقسیم می‌کنند. این مسافت را با خط شروع یکسانی می‌سنجند.
(الف)
(ب)
شکل(3-9):. نمایی از روش TLC
3-8-2-3) کاربرد کروماتوگرافی لایه نازک
کروماتوگرافی لایه نازک پر‌کاربردترین روش در صنایع داروسازی برای تمام اندازه‌گیری‌های مهم و تعیین درجه خلوص محصولات است. هم‌چنین، کاربرد گسترده‌ای در آزمایشگاه‌های بالینی پیدا کرده است و ستون فقرات مطالعات متعدد زیست شناسی و زیست شیمیایی شده است. بالاخره، کاربرد گسترده‌ای در آزمایشگاه‌های صنایع شیمیایی پیدا کرده است.
3-8-3) روش Spectrophotometric
روشهای جذب سنجی یکی از قدرتمندترین و رایج ترین روشهای اندازه گیری طیف وسیعی از آنالیت ها محسوب می‌شوند.
در روشهای اسپکتروفتومتری (طیف سنجی)، تاثیر محلولها بر امواج الکترومغناطیسی مورد مطالعه قرار میگیرد. محدوده طیف الکترومغناطیس می‌تواند از اشعه ماوراء‌بنفش تا امواج‌رادیویی باشد.
مقدار نور جذب شده توسط محلول، تابع قوانین Beer وLambert است و از رابطه A=e lc محاسبه می‌شود. طبق قانون بیر، هر گاه یک اشعه نور تک رنگ از درون محلولی با رنگ مکمل عبور کند، مقدار نور جذب شده توسط محلول، با غلظت آن نسبت مستقیم دارد. طبق قانون لامبرت، مقدار نور جذب شده توسط لایه‌های مختلف محلول همواره ثابت بوده و با شدت نور تابیده شده بستگی ندارد. بر اساس قوانین بیر و لامبرت رابطه بین غلظت محلول و نور جذب شده به صورت خطی است و معمولا در محدوده‌ای که جذب با غلظت رابطه خطی دارد، تعیین غلظت مواد انجام می‌شود. اگر غلظت نمونه و استاندارد به هم نزدیک باشد و غلظتها هم در محدوده خطی باشند، میتوان با استفاده از تناسب محاسبات را انجام داد.
دستگاه اسپکتروفتومتر از دو بخش اسپکترومتر و فتومتر تشکیل شده است. اسپکترومتر بخشی است که نور منوکروم را ایجاد کرده و دارای منبع نور، عدسی، شکافها، منوکروماتور (صافی یا منشور) می‌باشد. بخش فتومتر دارای اسباب سنجش نور است.
3-8-3-1) با اسپکتروفوتومترآشنا شویم (سفری با سرعت نوربین آینه ها)
اسپکتروفوتومتر یا طیف سنج، دستگاهی است که شدت نور را به صورت تابعی از طول موج اندازه‌گیری می کند. این کار با انکسار پرتو نور به طیف طول موج ها و آشکارسازی شدت ها با دستگاه بار دار و نمایش نتایج به صورت گراف انجام می‌شود. در حقیقت این روش با استفاده از میزان جذب نور، تعیین غلظت می‌کند. این روش قابلیت اندازه گیری نمونه های فوق العاده کوچک را داشته لذا از آن برای تجزیه و تحلیل عناصر مولکول‌هایDNA , RNA استفاده می‌شود.
نور از بسته های بسیار کوچکی به نام فوتون تشکیل شده است که انرژی هریک از آنها به محض برخورد به یک الکترون منتقل می شود. تنها هنگامی انتقال رخ می دهد که انرژی فوتون ها برابر با انرژی مورد نیاز برای انتقال الکترون به لایه انرژی بعدی باشد. این پروسه که در آزمایش‌های محاسبه کیفیت و کمیتDNA موجود در محلولها استفاده می شود، پایه طیف بینی جذبی را تشکیل می دهد. به طور کلی نور با طول موج و انرژی خاص به نمونه تابانده شده و مقدار مشخصی از انرژی آن جذب می شود. سپس با اندازه‌گیری انرژی رد شده از نمونه توسط یک فوتودتکتور، مقدار جذب تعیین می‌شود. اسپکتروفوتومتر دستگاه پیچیده‌ای است که شدت نور را به صورت تابعی از طول موج است اندازه‌گیری می کند. در این دستگاه نور توسط یک منبع نور تولید شده و پس از گذشتن از میان نمونه مورد نظر نور، به صورت طیفی منتشر می شود سپس به وسیله سنسورها آشکارسازی شده و به صورت نتایج قابل کاربردی ترجمه می‌شود. خروجی اسپکتروفوتومتر همیشه نموداری از شدت نور نسبت به طول موج است. داده‌هایی که برای تولید نمودار گردآوری شده، در جدولی از شدت نور و طول موج ذخیره می‌شود. مقدار گراف بیان کننده مقدار عبور یا مقدار جذب است. اسپکتروفوتومترهای امروزی دیجیتالی بوده و به وسیله میکروپروسسور کنترل می شوند.
3-8-3-2) قانون بیر-لامبرت:
وقتی یک دسته امواج تک رنگ نورانی را از یک محیط وارد یک محیط یکنواخت دیگر می شود قسمتی از آن منعکس و قسمتی از آن جذب محیط دوم شده و قسمتی دیگر از آن خارج می شود.
رابطه بین شدت نور تابش شده و نور خروجی در سال ۱۷۶۰ توسط لامبرت بدست آمد و بیر درسال ۱۷۶۲ درستی آن را درباره محلول ها بررسی نمود و نتیجه گرفت که این رابطه درمورد محلول ها نیز صادق است.
بر طبق قانون لامبرت افت نسبی شدت نور نسبت به ضخامت محیط جاذب نور، با شدت نور تابش شده متناسب است.
3-8-3-3) استفاده از اسپکتروفوتومتر
اسپکتروفوتومترها مستقیما برای اندازه‌گیری شدت نور در طول موج های مختلف استفاده می‌شود و می‌تواند نماینده درصد نور تابشی مخابره شده یا جذب شده باشد. با استفاده از این اطلاعات و مقایسه آن با دانسیته‌ها و داده‌های به دست آمده میتوان اسپکتروسکوپی را به عنوان یک ابزار استفاده کرد. مقایسه طیف‌ها برای تعیین غلظت جسم حل شده موجود در حلال مثال خوبی است. بدین ترتیب که با ثبت نور ارسال و دریافت شده در طول موجی خاص و بررسی طول موج جذب شده توسط حلال میتوان به غلظت آن پی برد. سپس آنالیز محلول با غلظت ناشناخته، با داده‌های معلوم مقایسه شده و به کمک تناسب غلظت محاسبه می‌شود. این عمل برای محلول‌هایی که در آنها چندین نوع حلال وجود دارد نیز قابل استفاده است والبته به دقت بیشتری در آنالیز طول موج‌ها احتیاج دارد. با توجه به حساسیت اسپکتروفوتومترFTIR مناسب‌ترین و رضایت‌بخش‌ترین روش آماده‌سازی نمونه، تبخیر ساده محلول نمونه در صفحه ای از نمک KBr و دست یافتن به طیفهای فیلم نازک باقی مانده است. این روش طیفی بسیار خوب با خط مبداء مسطح به وجود میآورد.
اسپکتروفوتومترهایی که منبع نور ندارند اما طیفهای مبنی بر نور وارده را تولید می‌کنند می‌توانند با روشی مشابه برای تعیین منبع نور استفاده شوند. میتوان منحنی طیفهای به دست آمده از منبع نوری نامعلوم (یا ترکیبی از منابع) را با اطلاعات منحنی‌های منبع نور مشخصی مقایسه کرد و منبع نور ناشناخته را شناسایی کرد.
از دیگر کاربردهای اسپکتروفوتومتر میتوان به تعیین ثابت موازنه واکنش های یونی که در محلول‌های آبی انجام می‌شود اشاره کرد. در ابتدا طیفهای محلولی که تنها شامل یک واکنش دهنده است اندازه‌گیری می‌شود. سپس دیگر واکنش دهنده‌ها به آن اضافه می‌شود و پس از هر بار افزایش، طیف سنجی صورت میگیرد. این روش در صورتی به صورت مطلوب کار می‌کند که طول موج جذب شده توسط محصول مقداری مشخص باشد. از آنجا‌که بیشتر محصولات از اضافه کردن چندین واکنشگر به دست می‌آیند، زمانی که محلول اشباع شده و واکنش موازنه می‌شود نورهای بیشتری جذب شده و افزایش نور جذب شده برابر ثابت موازنه است.
3-8-4) روش Bioassay
زیست‌سنجی(که بطور معمول به عنوان مختصر کلمه سنجش بیولوژیکی استفاده می‌شود) و یا استاندارد سازی بیولوژیکی، نوعی آزمایش علمی است. زیست‌سنجی به طور معمول برای اندازه گیری اثرات یک ماده بر روی یک ارگانیسم زنده انجام می‌شود و در توسعه داروهای جدید و نظارت بر آلاینده‌های زیست محیطی ضروری است. هر دو اینها روشهایی هستند که توسط آن قدرت یا ماهیت یک ماده، با مطالعه اثرات آن بر ماده زنده تخمین زده می‌شود. زیست‌سنجی، روشی برای تعیین غلظت یک ماده خاص از یک مخلوط است.
زیست‌سنجی روشی است که می‌تواند درجه خلوص یا فعالیت بیولوژیکی یک ماده از قبیل ویتامین، هورمون و فاکتور رشد گیاهی را تعیین نماید. در هرحال اندازه‌گیری اثر بر روی یک موجود زنده، سلول‌های بافت، آنزیمها یا رسپتور درمقایسه با یک فراورده استاندارد انجام می‌شود. زیست سنجی ممکن است کمی یا کیفی باشد. زیست‌سنجی‌های کیفی، برای ارزیابی اثرات فیزیکی یک ماده که ممکن است قابل اندازه‌گیری نباشند، مانند رشد غیر طبیعی یا تغییر شکل، مورد استفاده قرار می‌گیرند. نمونه‌ای از زیست سنجی کیفی شامل آزمایش معروف به آرنولد آدولف برتولد در جوجه‌های اخته است. این تجزیه و تحلیل نشان داد که با از بین بردن بافت بیضه یک جوجه، به یک خروس تبدیل نخواهد شد زیرا سیگنال های درون ریز لازم برای این فرایند در دسترس نیست.
زیست‌سنجی کمی شامل تخمین غلظت و یا قدرت یک ماده بوسیله اندازه‌گیری پاسخ‌های بیولوژیکی است که تولید می‌کند. زیست‌سنجی کمی به طور معمول با استفاده از روشهای آمار زیستی مورد تجزیه و تحلیل قرار میگیرد(60).
هدف:
اندازه‌گیری فعالیت‌های دارویی مواد تعریف نشده جدید و یا شیمیایی
بررسی عملکرد واسطه‌های درون‌زا
تعیین عوارض جانبی از جمله درجه سمیت دارو
اندازه‌گیری غلظت مواد شناخته شده
سنجش میزان آلاینده‌ها که توسط یک منبع خاص مانند فاضلاب و یا رواناب شهری منتشرمی‌شود
تعیین ویژگی آنزیم‌های خاص برای سوبستراهای خاص
3-8-4-1)سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین
فعالیت آنتی‌بیوتیک‌ها با اندازه‌گیری میزان اثر بازدارندگی رشد میکروارگانیسم‌ها سنجیده می‌شود. کاهش فعالیت ضد میکروبی، نشانگر اثرات ظریف و ناشناخته‌ای است که نمی‌توان با روشهای شیمیایی آنها را نشان داد. به همین دلیل سنجش میکروبیولوژیک آنتی‌بیوتیک‌ها در سندهای دارویی معتبر مانند USP، EP، AOAC به عنوان معیاری مهم برای رفع شبهات در مورد کاهش فعالیت احتمالی آنتی‌بیوتیک‌ها به کار می‌رود.
در سنجش میکروبیولوژیک، یک معیار واحد (potency ) برای کل فعالیت بیولوژیک یک محصول آنتی‌بیوتیک به صورت واحد ( unit ) آنتی‌بیوتیک فعال در واحد حجم ارائه می‌شود. این مقدار در مورد اریترومایسین پایه وزنی معادل 1 میکروگرم ماده خالص است.
در این روش، بررسی میزان فعالیت آنتی‌بیوتیک تولید شده به روش چاهک- پلیت و با استفاده از سویه حساس به اریترومایسین 9341Micrococcus Luteus انجام می‌شود. مراحل کار بر اساس USP 31 و AOAC به شرح زیر است:
3-8-4-2) محیط‌کشت پایه سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین
به منظور سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین از محیط‌های مولرهینتون آگار و مولر هینتون براث استفاده می‌شود.
3-8-4-2-1) محیط کشت مولر هینتون آگار
از این محیط به عنوان پایه سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین استفاده می‌شود. به این منظور طبق دستورالعمل مندرج بر روی ظرف حاوی این محیط، مقدار 36 گرم از محیط توسط ترازو توزین شده، با آب مقطر به حجم 1000 میلی لیتر رسانده شده و روی شعله قرار میگیرد تا چندین بار جوش
