آید و محیط یکنواخت گردد. سپس در داخل اتوکلاو استریل شده و در شرایط استریل زیر هود بیولوژیک و در مجاورت شعله در داخل پلیت‌های استریل به میزان 15 میلی‌لیتر از این محیط در داخل هر پلیت ریخته شد تا محیط در پلیت‌ها بسته شود و حالت جامد پیدا کند.
در این مرحله باید از تراز بودن سطح اطمینان حاصل شود. پیش از بسته شدن محیط داخل پلیت‌ها هیچ گونه جابجایی نباید صورت گیرد. پس از بستن محیط در داخل پلیت‌ها می‌توان باکتری را روی آن‌ها کشت داد.
3-8-4-2-2) محیط کشت مولر هینتون براث
برای ساخت این محیط به منظور تهیه سوسپانسیون میکروبی با استفاده از آن بر طبق دستورالعمل مندرج بر روی ظرف حاوی این محیط، 28 گرم در لیتر از محیط توسط ترازو توزین شده، با آب مقطر به حجم 1000 میلی لیتر رسانده و روی شعله حرارت داده می‌شود. پس از یکنواخت شدن در داخل لوله‌های درب دار ریخته شده و در اتوکلاو استریل می‌گردد.
به این ترتیب محیط برای اضافه کردن سویه باکتری Micrococcus luteus به منظور تهیه سوسپانسیون میکروبی آماده شده و می‌توان از آن برای کشت بر روی محیط مولر هینتون آگار استفاده نمود.
به منظور استخراج اریترومایسین تولید شده از محیط تخمیر، 2 میلی لیتر محیط نمونه گیری شده از داخل ارلن‌های تخمیر که حاوی اریترومایسین تولیدی و سایر اجزای محیط می‌باشد را در فالکون‌های استریل ریخته و به میزان 2 میلی‌لیتر از محلول بافر فسفات ( بافر شماره 3 که در ادامه نحوه ساخت آن آورده شده است) به عنوان حلال جهت استخراج به آن اضافه نموده و به مدت 15 دقیقه در شیکر قرار می‌دهند تا استخراج به طور کامل انجام گیرد و در ادامه با قرار دادن فالکون‌ها به مدت 20 دقیقه در سانتریفیوژ با دور rpm4000 سایر مواد ته نشین شده و اریترومایسین استخراج شده محلول در حلال بی‌اثر بدست آمد ( فاز رویی ) و پس از رقیق سازی به میکروتیوب‌های استریل 1 میلی‌لیتری جهت تزریق منتقل می‌شود.
3-8-4-3) تهیه مایه تلقیح
سویه حساس مورد استفاده در این حالت 9341 Micrococcus Luteus PTCC می‌باشد. لوله حاوی محیط مولر هینتون براث آماده شده را مدتی در محیط آزمایشگاه قرار داده تا با محیط هم‌دما شود. سپس زیر هود میکروبی و در مجاورت شعله با سواپ استریل مقداری از سویه حساس Micrococcus Luteus را برداشته و به لوله منتقل کرده و به مدت 2 دقیقه روی شیکر لوله قرار می‌دهند تا اختلاط انجام شود و سپس لوله در انکوباتور با دمای 34 درجه سانتیگراد و به مدت 1 ساعت گرما گذاری می‌شود.
پس از اتمام زمان مورد نظر، جذب سوسپانسیون ساخته شده با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 580 نانومتر خوانده می‌شود. در این طول موج میزان جذب باید بین 25 الی 30 باشد.
در صورت بالا بودن مقدار جذب خوانده شده، مقداری آب مقطر استریل به سوسپانسیون اضافه می‌گردد و در صورت پایین بودن آن لوله حاوی سوسپانسیون را مجددأ گرماگذاری کرده تا به جذب ایده آل برسد.
در این مرحله سوسپانسیون حاصل به پلیت‌های آماده شده اضافه می‌گردد.
از آنجایی که به ازای هر 1000 میلی‌لیتر محیط کشت مولر هینتون آگار 5/1 میلی‌لیتر سوسپانسیون باکتریایی اضافه می‌شود، به هر کدام از پلیت‌های حاوی محیط پایه 25/0 میلی‌لیتر سوسپانسیون باکتریایی اضافه کرده و با استفاده از سواپ استریل در سطح پلیت گسترانده و مدتی صبر می‌کنند تا کاملأ جذب شود.
3-8-4-4) ایجاد چاهک
در ابتدا در زیر هود میکروبی و در مجاورت شعله، نقاط مورد نظر برای ایجاد چاهک را در قسمت زیرین پلیت‌های سنجش میکروبیولوژیک با ماژیک ضد آب مشخص کرده، سپس چاهک‌ها را در نقاط مدنظر با انتهای پیپت پاستور استریل ایجاد می‌نمایند و بدین ترتیب حفره‌ها برای تزریق محلولهای استاندارد و نمونه‌های مجهول آماده می‌شوند.
3-8-4-5) تهیه بافر فسفات با 8 = pH
برای تهیه این بافر، 73/16 گرم دی بازیک پتاسیم فسفات و 523/0 گرم مونوبازیک پتاسیم فسفات را وزن کرده و در یک بالن ژوژه 1000 میلی لیتری با استفاده از آب مقطر به حجم می رسانند. سپس pH آن را با استفاده از pH متر اندازه گیری کرده و در صورت نیاز با استفاده از اسید فسفریک 18 نرمال یا پتاس 10 نرمال مقدار pH بر روی 8 تنظیم می گردد.
3-8-4-6) تهیه محلول های استاندارد
برای ساخت محلولهای استاندارد، ابتدا اریترومایسین استاندارد را از یخچال بیرون آورده و منتظر می‌مانند تا دمای آن به دمای محیط برسد. سپس با توجه به درصد ناخالصی، مقدار مورد نیاز از آن را وزن کرده و با استفاده از متانول و بافر فسفات، غلظت 100 میکروگرم در میلی‌لیتر اریترومایسین استاندارد تهیه می‌شود. سپس با استفاده از بافر فسفات (8=pH ) از روی آن غلظت 10 میکروگرم در میلی‌لیتر اریترومایسین و از روی غلظت 10، رقت های 64/0، 8/0، 1، 25/1، 56/1 میکروگرم در میلی‌لیتر از اریترومایسین ساخته می‌شوند.
3-8-4-7) افزودن محلولهای آنتی‌بیوتیک در پلیت‌ها
در هر یک از پلیت‌های مربوط به محلولهای استاندارد به میزان 100 میکرولیتر از رقت‌های مختلف 64/0، 8/0، 1، 25/1، 56/1 میکروگرم در میلی‌لیتر اریترومایسین ریخته می‌شود. به ازای هر یک از محلولهای استاندارد سه چاهک در سه پلیت و بدین ترتیب نه چاهک از استاندارد مورد نظر پر می‌گردد. این روند برای هر یک از نمونه‌های مجهول پس از استخراج و رقیق‌سازی اریترومایسین تولید‌شده نیز تکرار می‌شود. برای استاندارد میانی به دلیل اهمیت آن در رسم منحنی استاندارد و تصحیح داده‌ها، این کار به ازای هر حالت استاندارد یا مجهول صورت می‌گیرد. پس از اتمام انتقال محلول‌ها به پلیت‌ها مدتی صبر می‌کنند تا محلول‌ها به طور کامل جذب محیط آگار درون پلیت‌ها شوند. سپس پلیت‌ها در انکوباتور با دمای 33 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت گرماگذاری می‌شوند.
3-8-4-8) اندازه‌گیری قطر هاله مهار‌شده
پس از اتمام زمان گرماگذاری، پلیت‌ها را از انکوباتور بیرون آورده و قطر هاله رشد را توسط کولیس با دقت mm1/0 اندازه گیری می‌کنند. با توجه به قطر هاله اندازه‌گیری شده می‌توان به میزان فعالیت آنتی‌بیوتیک تولیدی و نقش آن در مهار رشد سویه حساس پی برد.
3-8-4-9) حذف و جایگزینی داده‌های گمراه‌کننده
در محاسبه فعالیت آنتی‌بیوتیک‌ها باید از داده‌های مطمئن استفاده شود و داده‌های حاشیه‌ای یا گمراه کننده باید کنار گذاشته شوند. حذف اختیاری اعداد گمراه‌کننده ممکن است عامل خطا باشد؛ بنابراین حذف با معیار زیر انجام شده است. ابتدا قطر هاله‌های مختلف در مورد یک غلظت استاندارد یا مجهول (Y) به ترتیب افزایشی از Y1 تا YN مرتب شده است. ( N تعداد مشاهدات هر گروه و برابر 9 است. )
سپس طبق فرمول زیر فاصله نسبی G محاسبه شده است :
( Y1 – YN-1 )/ ( Y1 – Y3 )= G
اگر G بیش از 725/0 باشد، معیار آماری برای حذف پاسخ گمراه کننده به دست می‌آید. با بررسی اعداد می‌توان عددی را که باید حذف شود دریافت. پس از حذف این عدد محاسبات تکرار می‌شود. اگر به حذف بیش از یک عدد نیاز باشد، دلیل بر عدم دقت آزمایش است. در این گونه موارد آزمایش باید تکرار گردد. با توجه به این که برای محاسبه فعالیت آنتی‌بیوتیک و حدود اطمینان پاسخ برای هر نمونه به تعداد معینی مشاهده نیاز است، بنابراین در صورت حذف یک عدد، میانگین مشاهدات دیگر محاسبه و جایگزین آن عدد شده است.
3-8-4-10) رسم منحنی استاندارد
در رسم منحنی استاندارد در ابتدا میانگین هاله‌های مهار رشد برای غلظت‌های استاندارد 64/0، 8/0، 25/1 و 56/1 میکروگرم بر میلی‌لیتر در هر پلیت با استفاده از استاندارد میانی( 1 میکروگرم بر میلی لیتر) تصحیح می‌شود. بر مبنای اعداد حاصل، قطر هاله مهار رشد بر حسب میلیمتر که به عبارت نشان دهنده پاسخ سویه حساس است به لگاریتم غلظت آنتی بیوتیک ترسیم گردیده و بدین ترتیب خطی با معادله b +ax =y حاصل می‌شود. پس از تصحیح قطر هاله مهار شده نمونه‌ها، با گزاردن مقادیر آن‌ها به جای پارامتر y در معادله خط، غلظت فعال اریترومایسین در نمونه‌ها حاصل می‌گردد.
3-8-5) استخراج اریترومایسین
در این پروژه از روش اسپکتروفتومتری برای سنجش غلظت اریترومایسین استفاده شده است. در روش اسپکتروفتومتری، غلظت اریترومایسین تام موجود در محیط سنجیده می‌شود و به این روش نمی‌توان تفاوت بین اریترومایسین‌ها را دریافت. روش سنجش غلظت اریترومایسین در زیر شرح داده شده است.
3-8-5-1)تهیه محلولهای استاندارد اریترومایسین
مقدار mg 1/102 اریترومایسین توزین گردید. مقدار واقعی اریترومایسین در نمونه توزین شده را با توجه به خلوص آن می‌توان چنین محاسبه کرد:
96/2 mg = (942µg)/(100µg) × 102/1 = مقدار واقعی اریترومایسین توزین شده
اریترومایسین توزین شده در یک بالن ژوژه به حجم ml100ریخته می‌شود و با توجه به اینکه حلالیت اریترومایسین در آب کم است، جهت افزایش حلالیت به بالن ژوژه ابتدا ml 5 اتانل که یکی از حلالهای اریترومایسین است اضافه می‌شود و به مدت 15-10 دقیقه تکان داده می‌شود تا کاملا حل شود. سپس محتوی بالن ژوژه را با بافر6/9pH به حجم رسانیده و کاملا مخلوط می‌کنیم. محلول حاصل، محلول استاندارد اولیه (initial solution) نامیده می‌شود و تا دو هفته قابل نگه‌داری در یخچال است. این محلول (µg)/mg 962 اریترومایسین دارد.
برای تهیه محلول میانی استاندارد (intermediate solution)، 5 میلی‌لیتر از محلول استاندارد اولیه در بالن ژوژه ml 50 ریخته شده و با بافر کربنات-بی‌کربنات با 6/9 pH به حجم رسانیده شده است.
غلظت اریترومایسین در محلول میانی چنین است:
96/2 (µg)/mg= (5 ml)/(50 ml) × (µg)/mg 962 = غلظت اریترومایسین در محلول میانی
سپس با مخلوط کردن بافر6/9 pH و محلول میانی بر طبق جدول(3-7) محلولهای کار اریترومایسین استاندارد تهیه می‌شود.
4/81 (µg)/mg = (0/5 ml)/(10 ml) × (µg)/mg 96/2 = غلظت اریترومایسین در محلول کار شماره 1
9/62 (µg)/mg = (1 ml)/(10 ml) × (µg)/mg 96/2 = غلظت اریترومایسین در محلول کار شماره 2
19/24 (µg)/mg = (2 ml)/(10 ml) × (µg)/mg 96/2 = غلظت اریترومایسین در محلول کار شماره 3
28/86 (µg)/mg= (3 ml)/(10 ml) × (µg)/mg 96/2 = غلظت اریترومایسین در محلول کار شماره 4
38/48 (µg)/mg = (4 ml)/(10 ml) × (µg)/mg 96/2 = غلظت اریترومایسین در محلول کار شماره 5
48/1 (µg)/mg = (5 ml)/(10 ml) × (µg)/mg 96/2 = غلظت اریترومایسین در محلول کار شماره 6
جدول(3-7): غلظت‌های اریترومایسین در حجم‌های استاندارد اریترومایسین و حجم‌های مورد نیاز برای تهیه آن‌ها
غلظت اریترومایسین درمحلول کار(µg)/mg
بافراشباع‌ازکلروفرم
حجم محلول‌میانی‌استاندارد (ml)
شماره
0
10
0
1
81/4
5/9
5/0
2
62/9
9
1
3
24/19
8
2
4
86/28
7
3
5
48/38
6
4
6
1/48
5
5
7
3-8-5-2)تهیه رقت‌های مایع تخمیر
مایع تخمیر حاوی اریترومایسین به صورت محلول در آب، میسلیوم‌های S.erythreae و اجزاء باقی‌مانده محیط‌کشت به دو صورت محلول و نامحلول است. بخش نامحلول شامل اجزاء جامد(کربنات کلسیم) و روغن باقی‌مانده است. با توجه به اینکه روغن باقی‌مانده به علت حل شدن در کلروفرم در مراحل بعدی سنجش ایجاد تداخل می‌کند بنابراین برای حذف لایه روغنی، مایع تخمیر به مدت 20 دقیقه در rpm 4000 سانتریفوژ شده و از لایه میانی حاصل از سانتریفوژ (یعنی محلول در آب) رقت‌های اعشاری لازم تهیه شد.
3-8-5-3) استخراج اریترومایسین از مایع تخمیر
در هر یک از ارلن‌های درپوش‌دار با حجم ml 100، ml 1 از مایع تخمیر رقیق شده در مرحله قبل یا محلولهای اریترومایسین استاندارد ریخته شده و به آن ml 9 بافر 6/9 اشباع از کلروفرم و ml 10 کلروفرم اشباع از بافر اضافه کرده و پس از گذاشتن درپوش‌ها، ارلن‌ها به مدت 30 دقیقه در شیکر به‌شدت به هم زده شده تا استخراج اریترومایسین با کلروفرم کامل شود. محتویات هر ارلن در rpm 4000 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ شده تا فازهای آبی و آلی از یکدیگر جدا شود. فاز آبی(رویی) به کمک پی پت پاستور به دقت جدا شده
