تحقیق با موضوع مورفومتری، نمونه برداری، سطح معنی داری

دانلود پایان نامه ارشد

نشده اند: اندازه مثلث ها نشان دهنده تعداد گونه های هر بخشه است (برای مثال، Andinium و Melanium حدود 100 گونه؛ Stolonosae حدود 20 گونه و Rubellium 3-4 گونه).گروه های تعیین توالی نشده در سمت راست قرار دارند و موقعیت پیش بینی شده آنها با فلش مشخص شده است (Ballard et al., 1999).

شکل 1-13-3-3 درخت مطلق مرکزی از 8300 درخت با بیشترین پارسیمونی بر اساس توالی ITS: حمایت Bootsrap بالاتر از 50% در بالای شاخه ها مشخص شده است (Yockteng et al., 2003).

شکل 1-13-3-4 درخت Strict consensus از 4 درخت بدست آمده از داده های ISSR از 25 گونه Melanium و 7 گونه به عنوان Outgroup. حمایت Bootsrap بالاتر از 50% در بالای شاخه ها مشخص شده است (Yockteng et al., 2003).

Vandenhof و همکاران (2008) روابط فیلوژنتیکی گونه های زیر بخشه Rostratae در غرب اروپا را با استفاده از 2 نشانگر اینترون trnS-trnG و قطعه بین ژنی پلاستیدی، و ژن کم کپی هسته ای Chalcone Synthase (CHS)، بررسـی کردند (شکل 1-13-3-5 و 1-13-3-6). CHS آنزیم کلیدی سنتز فلاونوئید هاست که در ساختن رنگیزه های گلی نقش مهمی دارد. ژن های کد کننده CHS، اعضای یک خانواده چند ژنی هستند. در Viola، 3 کپی از این ژن موجود است. این مطالعه، فرضیه های اولیه در مورد روابط شبکه ای بین گونه های زیر بخشه Rostratae بر اساس داده های کاریوتیپی را تأیید کرد. مقایسه درخت دودمان ژنی CHS و فیلوژنی بر اساس پلاستید، نشان داد که کپی های متفاوت CHS از Duplication های قدیمی و اخیر بوجود آمده اند.

شکل 1-13-3-5 درخت فیلوژنی با بیشترین پارسیمونی از 200000 درخت رسم شده بر اساس توالی بین ژنی trnS-trnG پلاستیدی (Vandenhof et al., 2008).

Marcussen و همکاران (2010 ) برای نشان دادن روابط فیلوژنی سرده Viola از RNA پلی مراز IV و V (POL IV, POL V) وابسته به DNA که یک آنزیم چند زیر واحدی است و در گیاهان دیده می شود، استفاده کردند (شکل 1-13-3-7 ). منشا POL V در آنژیواسپرم ها از POL IV است که در تمام گیاهان خشکی وجود دارد و به دو ژن کد کننده زیر واحد بزرگ و عملکرد آن در دو پارالوگ NRPD1 و NRPE1 مرتبط است. دومین زیر واحد بزرگ، NRPD2/NRPE2 است که به صورت مستقل در برخی از دو لپه ای ها دیده می شود (Marcussen et al. 2010) (شکل 1-13-3-8 ).

شکل 1-13-3-7 درخت فیلوژنی NRPD2a/E2-a و NRPD2/E2-b در Viola .(Marcussen et al. 2010) Allexis botangae به عنوان برون گروه انتخاب شده است. حمایت Bootstrap به صورت درصد مشخص شده است. مقادیر MP در بالای شاخه ها و ML در پایین شاخه ها قرار داده شده است ( بر اساس 100 تکرار). گونه ها بر اساس بخشه ها در رنگ های مختلف آورده شده است.

شکل 1-13-3-8 مشخصات توالی NRPD2/E2. A موقعیت مرتبط NRPD2/E2 در آرابیدوپسیس که برای تکثیر در Violaceae استفاده شده است. B مناطق اختصاصی در Violaceae .(Marcussen et al. 2010)

1- 14 اهداف این تحقیق:
– بازسازی روابط فیلوژنی سرده و بخشه در چارچوب فیلوژنی مولکولی بر مبنای داده های مولکولی حاصل از توالی های nrDNA ITS و cpDNA trnL-F و مقایسه آنها
– برقراری روابط خویشاوندی میان بخشه هایی از سرده Violaceae موجود در ایران
– تایید حضور و تفکیک گونه V. reichenbachiana در ایران
– جداسازی دو گونه نزدیک V. alba ssp. alba و V. sintenisii

2-1 مطالعات تشریحی
به منظور انجام این مطالعات، از نمونه های تازه و هرباریومی استفاده شد. قسمت هایی از دمگل، دمبرگ، ساقه رونده ، برگ و ریشه هر نمونه انتخاب شد و سعی شد که این قسمت ها از نظر اندازه در همه نمونه ها یکسان باشند. نمونه های هرباریومی به مدت 3 روز در الکل اتیلیک 70% تثبیت گردید. سپس برش گیری به روش دستی انجام شد و رنگ آمیزی با آبی متیلن و قرمز کنگو صورت گرفت.
مراحل انجام شده به صورت زیر می باشد:
1. نمونه برداری از قسمتی از بافت دمگل، دمبرگ، ساقه رونده و ریشه، به طوریکه تقریباً از یک ناحیه مشابه تهیه شوند.
2. تثبیت نمونه ها در الکل اتیلیک 70% به مدت 3 روز (فقط برای نمونه های هرباریومی).
3. برشگیری عرضی از قسمت های ذکر شده به روش دستی و با استفاده از تیغ های تجاری.
4. 2-3 بار شستشوی برشها در آب مقطر (برای نمونه های هرباریومی تثبیت شده در الکل اتیلیک 70%، زیرا رنگ های مورد استفاده، محلول در آب هستند).
5. قرار دادن برشهاي تهيه شده در محلول آب ژاول 10% به مدت 6-5 دقيقه. اين مرحله به منظور پاك سازي محتويات داخل سلولها انجام مي گيرد، مدت زمان انجام اين مرحله به صورت چشمی با مشاهده تغيير رنگ برشها به رنگ سفيد تعيين مي شود. قابل توجه است كه قرارگيري برشها در مجاورت آب ژاول به مدت زمان بيشتر منجر به تخريب سلولها مي شود.
6. 3-2 بار شستشو با آب مقطر.
7. قرار دادن برش ها در اسید استیک 10% به مدت 2-1 دقیقه.
8. 2-3 بار شستشو با آب مقطر.
9. رنگ آمیزی برش ها با رنگ آبی متیلن به مدت 2-1 دقیقه.
10. شستشو با آب مقطر.
11. رنگ آمیزی برش ها با رنگ قرمز کنگو به مدت 6-5 دقیقه.
12. شستشوی برش ها با آب مقطر به طوریکه رنگ اضافی به طور کامل خارج شود.
13. در نهایت برای تثبیت نمونه ها روی لام از چسب ژلاتین استفاده شد.

2-1-1 روش تهیه محلول های رنگ آمیزی
رنگ آبی متیلن
مواد مورد نیاز
پودر آبی متیلن g 2/0
آب مقطر ml 100
g 2/0 پودر آبی متيلن را در ml 100 آب مقطر به طور كامل حل کرده، سپس از صافي عبور مي‌دهيم.

رنگ قرمز کنگو
مواد مورد نیاز
پودر قرمز کنگو g 5
آب مقطر ml 100
g 5 پودر قرمز كنگو را در ml 100 آب مقطر به طور كامل حل كرده، سپس از صافي عبور مي‌دهيم.

روش تهیه چسب ژلاتین
مواد مورد نیاز:
پودر ژلاتین g 10
گلیسرین ml 80
بلور فنل g 2
آب مقطر ml 70
g 10 پودر ژلاتين را با ml70 آب مقطر مخلوط کرده، درون بن ماري با دمای ºc 100 قرار می دهیم تا به آرامی ذوب شود، سپس ml 80 گليسرين و g 2 بلور فنل به آن اضافه كرده و مجدداً درون بن ماري قرار می دهیم. پس از 8-7 ساعت محلول را از بن ماری خارج کرده و اجازه می دهیم تا سرد شود. این چسب در دمای اتاق قابل نگهداری است و برای هر بار استفاده می توان آن را مجدداً ذوب نمود. برای تثبیت لام، یک قطره از چسب ذوب شده را روی نمونه گذاشته و لامل را روی آن قرار می دهیم؛ پس از سرد شدن لام تثبیت شده قابل نگهداری است.

مشخصات هرباریومی
Species
گیلان: اسالم، 13681-GUH، اسفند88، یوسفی، وافی
V. caspia ssp. caspia
گیلان: گردنه الماس، 13753-GUH، فروردین 89، یوسفی، وافی
V. capia ssp. sylvestroides
گیلان: جاده اسالم به خلخال، 13651-GUH، اردیبهشت 89، یوسفی، وافی
V. reichenbachiana
اردبیل: گردنه الماس، 13672-GUH، اردیبهشت 88، یوسفی و اسعدی
V. rupestris
گیلان: لاهیجان، 13264-GUH، اردیبهشت 88، یوسفی، سعیدی
V. alba ssp. alba
گیلان: گردنه حیران، 13479-GUH، اسفند 87، یوسفی و سعیدی
V. odorata
گیلان: لاهیجان، شیطان کوه، 13721-GUH، بهمن 88، یوسفی، وافی
V. sintenisii

2-2 بررسی مورفومتری و آنالیز عددی

2-2-1 نمونه برداری
طی نمونه برداری که از بیش از 100 رویشگاه در شمال ایران (از گردنه حیران تا پارک ملی گلستان) از پاییز 88 تا تابستان 90 صورت گرفت، بیش از 650 نمونه گیاهی از 6 گونه و زیر گونه Viola جمع آوری گردید (پیوست، رویشگاه های مورد مطالعه، تاریخ و گونه های جمع آوری شده، شکل2-2-1). پس از خشک کردن و پرس کردن نمونه ها (موجود در هرباریوم دانشگاه گیلان)، شناسایی اولیه صورت گرفت و آنالیز مورفومتری بر روی 185 نمونه از بخشه Viola انجام شد.

2-2-2 اندازه گیری و آنالیز
به این منظور، 26 صفت شامل 21 صفت کمی، 2 صفت کیفی و 6 نسبت بدست آمده از صفات کمی مورد ارزیابی قرار گرفت )جدول 2-2-1).

شکل 2-2-2، برخی صفات مورفومتری اندازه گیری شده، A: طول مهمیز، B: طول دمگل، C: فاصله برگه تا قاعده دمگل، D: طول کپسول، E: عرض برگ، F: طول برگ، G: عمق سینوس، H: طول دمبرگ، I: عرض گلبرگ

برگ
1- a) طول پهنک (mm)
2- b) عرض پهنک (mm)
3- c) عمق سینوس (mm)
4- نسبت a/b
5- نسبت c/a
6- تعداد دندانه ها در یک طرف پهنک
7- کرک (mm)
گوشوارک
8- a) طول (mm)
9- b) عرض (mm)
10- نسبت a/b
11- اندازه ریشک51 (mm)
دمبرگ
12- a) طول (mm)
13- b) طول میان گره ساقه در محل اتصال همان دمبرگ (mm)
14- نسبت a/b
15- کرک (mm)
دمگل
16- کرک (mm)
ساقه رونده
17- میانگین طول میان گره (mm)
ریزوم
18- ضخامت (mm)
برگه
19- a) فاصله از محل قرار گیری روی دمگل تا گل (cm)
20- b) فاصله از محل قرار گیری روی دمگل تا قاعده دمگل (cm)
21- نسبت a/b
گل
22- رنگ گل
23- طول مهمیز (mm)
24- رنگ مهمیز
کاسبرگ
25- a) طول (mm)
26- b) عرض (mm)
27- طول زایده (mm)
28- نسبت a/b
میوه
29- طول کپسول (mm)

صفات مربوط به برگ، دمبرگ و گوشوارک بر روی یک برگ با اندازه مناسب از هر گیاه و صفات مربوط به دمگـل، کاسه و جام گل بر روی یک گل Ch. (بزرگترین گل) از هر گیاه اندازه گیری شده و وارد ماتریکس اولیه داده ها شد.
صفات وارد شده در آنالیز مورفومتری، شامل صفات معمول مورد استفاده برای تعیین حدود تاکسون ها در بخشه Viola، و یا مورد استفاده در تاکسونومی مدرن و مقالات مورفومتری بودند(e.g. Marcussen & Nordal, 1998; Marcussen et al., 2001; Marcussen, 2003).
به دلیل اینکه گونه های سرده Viola، در سطح بخشه و زیر بخشه، به راحتی قابل شناسایی هستند و همچنین صفات اندازه گیری شده برای همه گونه ها یکسان نیستند، آنالیز های مورفومتری تنها در سطح گونه و برای هر کدام از زیربخشه های Viola و Rostratae از بخشه Viola، انجام شد.
به منظور بررسی سطح معنی داری52 صفات انتخاب شده، با استفاده از نرم افزار SPSS (ver. 16.0)، تست تشخیص53 برای هر دو گونه54 به صورت جداگانه انجام شد و صفات با سطح معنی داری بیشتر از 0.05 از ماتریکس حذف شدند؛ سپس با استفاده از نرم افزار NTSYS-pc (ver. 2)، ماتریکس عدم تشابه با ضریب اقلیدسی، برای دو زیربخشه Viola و Rostratae، محاسبه شد و دندروگرام به روش UPGMA رسم شد. در نهایت آنالیز تجزیه به مؤلفه های اصلی55 (PCA) نیز انجام شد.
2-3 مطالعه ی فیلوژنی مولکولی در گونه های Viola
برای این منظور از نمونه های تازه و هرباریومی استفاده شد. از هر گونه 1 تا 3 نمونه از جمعیت های مختلف مورد آزمایش قرار گرفت. فهرست نمونه های استفاده شده در این مطالعات در جدول 2-4-1 ذکر شده است.

مشخصات هرباریومی
Species
گیلان: لاهیجان، شیطان کوه، 13721-GUH، بهمن 88، یوسفی، وافی
V. sintenisii
گیلان: گردنه حیران، 13479-GUH، اسفند 87، یوسفی و سعیدی
V. odorata
گیلان: لاهیجان، شیطان کوه، 13686-GUH، بهمن 87، یوسفی
V. caspia ssp. caspia1
گیلان: کیاشهر، 13653-GUH، خرداد 88، یوسفی و Marcussen
V. caspia ssp. caspia2
گیلان: گردنه الماس، 13753 -GUH، اسفند 88، وافی، سعیدی
V. caspia ssp. sylvestroides
گیلان: جاده اسالم به خلخال، 13687-GUH، خرداد 88، یوسفی و Marcussen
Hybrid_ V.caspia × V. reichenbachiana
گیلان: جاده اسالم به خلخال، 13651-GUH، اسفند 88، یوسفی، وافی
V. reichenbachiana
اردبیل: گردنه الماس، 2-13485-GUH، اردیبهشت 87، یوسفی و اسعدی
V. rupestris
گیلان: توتکابن، 13660-GUH، اردیبهشت 88، یوسفی و سعیدی
V. alba ssp. alba 1
گیلان: لاهیجان،

پایان نامه
Previous Entries تحقیق با موضوع تاکسونومی، ریخت شناسی، انتخاب طبیعی Next Entries تحقیق با موضوع میکروتیوب، lµ، rpm