انکوباتورها

دانلود پایان نامه ارشد

شاخصهاي بارداري آنها در کروماتوگرافي گازي و مقايسه آنها با شاخصهاي موجود در کتب مرجع و مقالات و با استفاده از طيفهاي جرمي ترکيبات استاندارد و استفاده از اطلاعات موجود در کتابخانه کامپيوتري صورت گرفت. محاسبات کمي تعيين درصد هر ترکيب به کمک داده پرداز Chromatopac C-R3A به روش نرمال کردن سطح و ناديده گرفتن ضرايب پاسخ مربوط به طيفها انجام شد.
3-7-4-3- محتواي کلروفيلهاي a، b و کاروتنوئيدها در برگ
براي اندازهگيري محتواي کلروفيل برگ از روش ليچتنهيلر و بوشمن [170] استفاده شد. در اين روش 5/0 گرم از پهنک برگ پيچک به قطعات کوچکي خرد شد و در داخل هاون چيني به همراه 5 ميليليتر استون 80% به طور کامل له گرديد. نمونه حاصل با استفاده از کاغذ صافي، صاف گرديد. مواد باقيمانده مجدداً به هاون منتقل گرديد و 10 ميليليتر استون براي حل شدن باقيمانده کلروفيل استفاده شد به طوري که مواد باقيمانده در کاغذ صافي کاملاً سفيد فاقد کلروفيل شد. عصاره حاصل به مدت 20 دقيقه در دستگاه سانتريفيوژ با سرعت 4000 دور در دقيقه (rpm) سانتريفيوژ شد. پس از سانتريفيوژ محتواي هر لوله آزمايش با استون 80 درصد به حجم 15 ميليليتر رسانده شد و آنگاه ميزان جذب نوري هر يک از نمونهها توسط اسپکتروفتومتر در طول موجهاي 6/661، 8/644 و 470 نانومتر قرائت شد. در نهايت غلظت کلروفيل و کاروتنوئيد (ميليگرم در گرم برگ تازه) با استفاده از روابط زير محاسبه گرديد.
a غلظت کلروفيل= ((24/11 × A 6/661 – 04/2 × A 8/644 ) × ميليگرم استون) / ميليگرم برگ تازه
bغلظت کلروفيل = ((13/20 × A 8/644 – 19/4 × A 6/661 ) × ميليگرم استون) / ميليگرم برگ تازه
غلظت کاروتنوئيد = (((1000 × A 470 -9/1Ca – 14/63Cb) /214) × ميليگرم استون) /ميليگرم برگ تازه

3-7-4-4- فعاليت آنزيمهاي آنتياکسيداني برگ
جدول 3-2 نشان دهنده تعدادي از آنزيم‌هاي مهم آنتياکسيداني و واکنشهاي مربوط به آنها ميباشد.
جدول3-2- آنتياکسيدانهاي آنزيمي مهم در گياهان و مکانيسم عمل آنها
واکنشي که توسط آنزيم کاتاليز ميشود
کد آنزيم
آنزيم‌هاي آنتياکسيداني
O2.- + O2.- + 2H+ 2H2O2 + O2
EC 1.15.1.1
Superoxide dismutase (SOD)
H2O2 H2O + 1/2 O2
EC 1.11.1.6
Catalase (CAT)
H2O2 + AA 2H2O + DHA
EC 1.11.1.11
Ascorbate peroxidase (APX)
H2O2 + GSH H2O + GSSG*
EC 1.11.1.7
Guaicol peroxidase (GPX)
MDHA + NAD(P)H AA + NAD(P)+
EC 1.6.5.4
Monodehydroascorbate reductase (MDHAR)
DHA + 2GSH AA + GSSG
EC 1.8.5.1
Dehydroascorbate reductase (DHAR)
GSSG + NAD(P)H 2GSH + NAD(P)+
EC 1.6.4.2
Glutathione reductase (GR)
به منظور استخراج آنزيم‌هاي مورد بررسي بافر استخراجي به شرح زير و طبق روش بيلي و همکاران [34] با کمي تغييرات تهيه شد. بدين منظور محلولي شامل ترکيبات دي فسفات سديم و مونوفسفات سديم (50 ميلي
* GSSG, oxidized glutathione
مولار) با 7pH=،EDTA133 2 ميليمولار، تريتون 100-X 2/0 درصد، ونيلپليپيروليدين (PVP134) 1 درصد، Tris-HCl 50 ميليمولار، 135DTT 2 ميليمولار، در آب ديونيزه استريل بر روي گرمکن چرخان مغناطيسي حل شدند و pH بافر استخراج بر روي 8/7 تنظيم شد. همه مراحل استخراج در دماي 4 درجه سانتيگراد انجام شد و قرائت جذب همه آنزيمها نيز با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل U-1800 HITACHI-Japan) انجام شد.
بعد از تهيه بافر استخراج، 1/0 گرم از نمونه برگي منجمد شده با استفاده از ازت مايع درون هاوني که از قبل در دماي 4 درجه سانتيگراد قرار داده شده بود، پودر شده و به آنها 1 ميليليتر از بافر استخراج اضافه شد و درون ويالهاي استريل ريخته و ويالها به دستگاه سانتريفيوژ يخچالدار مدل Eppendorf (5810R) به مدت 30 دقيقه با 14000 دور در دقيقه (rpm) در دماي 4 درجه سانتيگراد، منتقل گرديدند. بعد از گذشت اين مدت از قسمت رويي محلول موجود در ويال براي سنجش فعاليت آنزيمها استفاده شد.لازم به ذکر است که کليه وسايل مورد نياز در اين آزمايش با استفاده از اتوکلاو استريل شده بودند. در کليه موارد، پروتئين با روش بردفورد با استفاده از آلبومين سرم گاوي (BSA) به عنوان استاندارد (در محدوده غلظتهاي صفر تا 50 ميکروگرم بر ميليليتر BSA) اندازهگيري شد [51].
الف- فعاليت آنزيم کاتالاز
براي سنجش فعاليت آنزيم کاتالاز از روش کاهش مقدار پراکسيد هيدروژن (H2O2) استفاده شد. فعاليت اين آنزيم طبق روش چنس و ميلي [64] اندازهگيري شد. براي اين منظور ابتدا به داخل کوئت 3 ميليليتر بافر فسفات (50 ميليمولار و 7 pH=) ريخته شد و سپس 51/4 ميکروليتر پراکسيد هيدروژن H2O2)) به آن اضافه شد و خوب تکان داده شد تا درهم آميزند. کوئت درون دستگاه اسپکتروفوتومتر قرار داده شد و دستگاه روي طول موج ??? نانومتر تنظيم گرديد و با استفاده از کوئت شاهد، صفر شد.
محلول کاليبره کننده136 شامل 3 ميليليتر بافر فسفات سديم (50 ميليمولار، 7 pH=) و 51/4 ميکروليتر پراکسيد هيدروژن (30 درصد) به استثناي عصاره بود. براي اندازهگيري ميزان فعاليت آنزيم در هر نمونه استخراج شده گياهي، هر بار به همين ميزان بافر فسفات و H2O2 به کوئت اضافه شد و سپس ميزان ?? ميکروليتر از عصاره گياهي توسط سمپلر برداشته و به کوئت نمونه اضافه گرديد و مجدداً به هم زده شد و سريع در محل خود در دستگاه قرار داده شد و هر 30 ثانيه تا مدت 2 دقيقه عدد دستگاه قرائت شد. با افزايش فعاليت آنزيم کاتالاز که ميتواند ناشي از تاثير تنشها باشد، دادههاي دستگاه سير نزولي پيدا ميکنند زيرا با افزايش فعاليت اين آنزيم H2O2 بيشتري تجزيه ميگردد و کاهش غلظت اين ماده در محلول نمونه باعث کاهش در کميت جذب نوري ميگردد. در نهايت فعاليت آنزيمي به صورت ?A240.min-1.mg-1 protein بيان شد.
ب- فعاليت آنزيم گلوتاتيون ردوکتاز
براي اندازهگيري فعاليت آنزيم مذکور ابتدا دو فالکون براي تهيه دو محلول متفاوت آماده شد. در يکي از آنها 3 ميليليتر بافر فسفات همراه با 00183/0 گرم گلوتاتيون ديسولفيد137 (GSSG) ريخته شد و خوب تکان داده شد تا کاملاً با يکديگر مخلوط گردند. در فالکون بعدي، همانند قبل 3 ميليليتر بافر فسفات ريخته شد و سپس 000125/0 گرم نيکوتيناميدآدنيندينوکلئوتيد فسفات138 (NADPH) به آن اضافه گرديد و خوب مخلوط شد تا محلول يکدستي به دست آمد.
در ادامه کار دستگاه اسپکتروفوتومتر روي طول موج 340 نانومتر تنظيم شد و کوئت شاهد که حاوي 2100 ميکروليتر بافرفسفات، 300 ميکروليتر گلوتاتيون ديسولفيد و 300 ميکروليتر نيکوتيناميد آدنين دينوکلئوتيد فسفات بود براي صفر کردن دستگاه در آن قرار داده شد. سپس براي هر نمونه عصاره گياهي، 300 ميکروليتر عصاره بر روي کوئت حاوي ترکيبات فوق ريخته شد و پس از چند تکان که باعث ترکيب کامل مواد ميشد در دستگاه قرار گرفت و هر 30 ثانيه و به مدت 2 دقيقه عدد دستگاه قرائت شد. در نهايت فعاليت آنزيمي به صورت ?A340.min-1.mg-1protein بيان شد.
ج- فعاليت آنزيم اسکوربات پراکسيداز
مکانيسم جذب نور در سنجش فعاليت اين آنزيم بر مبناي غلظت آسکوربات محلول ميباشد. فعاليت اين آنزيم با استفاده از روش ناکانو و آسادا [201] اندازه گيري شد. لذا با افزايش فعاليت اين آنزيم روند شدت جذب نزولي ميباشد. به منظور قرائت فعاليت آنزيم آسکوربات پراکسيداز، دستگاه را روي طول موج 290 نانومتر تنظيم کرده و به داخل کوئت 3 ميليليتر بافر فسفات سديم (50 ميليمولار، 7 pH=) و 51/4 ميکروليتر پراکسيد هيدروژن (30 درصد)، 100 ميکروليتر از آسکوربات 5 ميليمولار و 50 ميکروليتر از عصاره استخراجي اضافه کرده و خوب تکان داده و کوئت را در محل خود قرار داده و در ثانيه اول و در طي دو دقيقه عدد دستگاه قرائت شد. محلول کاليبره کننده شامل 3 ميليليتر بافر فسفات سديم، 51/4 ميکروليتر پراکسيد هيدروژن (30 درصد) و 100 ميکروليتر از آسکوربات 5 ميليمولار به استثناي عصاره بود. در نهايت فعاليت آنزيمي به صورت ?A290.min-1.mg-1protein بيان شد.
د- فعاليت آنزيم سوپراکسيد ديسموتاز
براي اين منظور ابتدا محلول متيونين تهيه شد، به اين ترتيب که بسته به حجم مورد نياز بر اساس نمونهها، نسبت حجمي 100 ميليليتر بافر فسفات با 1937/0 گرم متيونين در ارلن ريخته شد و با استفاده از همزن مغناطيسي به خوبي هم زده شد و محلول يکدستي به دست آمد. سپس 3 ميليليتر از محلول فوق در کوئت شاهد ريخته شد و به آن 9/3 ميکروليتر ريبوفلاوين139 و 189 ميکروليتر نيتروبلوتترازوليوم140 (NBT) اضافه شد و مواد خوب بهم زده شد و درون دستگاه که روي طول موج 560 نانومتر تنظيم شده بود قرار گرفت و دستگاه بدين وسيله صفر شد.
براي هر نمونه 50 ميکروليتر عصاره گياهي مورد نظر به کوئت حاوي مواد ذکر شده اضافه گرديد و عدد دستگاه هر 30 ثانيه و به مدت 2 دقيقه خوانده شد. هر نمونه پس از قرائت درون لولههاي آزمايش ريخته شد و به مدت 15 دقيقه زير نور مهتابي قرار گرفت و پس از گذشت اين مدت مجدداً داخل دستگاه قرار گرفت و طبق روش قبل، قرائت شد. در نهايت فعاليت آنزيمي به صورت ?A560.min-1.mg-1protein بيان شد.
3-8- تجزيه و تحليل آماري دادهها
ميانگين صفاتي که بر اساس تک بوته اندازهگيري شده بودند در برداشت سال اول و سال دوم در قالب طرح بلوکهاي کامل تصادفي به طور جداگانه مورد تجزيه واريانس قرار گرفتند. دادههاي مربوط به انکوباتورهاي نوري و فلورسنت، بر اساس طرح کاملاً تصادفي در قالب آزمايش تجزيه مرکب مورد بررسي قرار گرفتند. تجزيه آماري در آزمايش اثرات متقابل بين کيفيتهاي نور و قارچ ميکوريزا در قالب طرح کاملاً تصادفي، آزمايش فاکتوريل و تجزيه طرح مرکب انجام شد. همچنين تجزيه آماري براي صفات کلروفيل، کاروتنوئيد و آنتياکسيدانهاي آنزيمي در قالب طرح کاملاً تصادفي انجام شد. تمامي تجزيه و تحليلهاي آماري مذکور توسط نرمافزار اس. ا. اس. و رسم نمودارها با استفاده از نرم افزار اکسل صورت گرفت و مقايسه ميانگينها با استفاده از آزمون حداقل تفاوت معنيدار در سطح احتمال يک يا 5 درصد انجام شد.

فصل چهارم
نتايج و بحث

4-1- مناطق جمعآوري ژنوتيپهاي نعناع
چهل ژنوتيپ از 3 گونه مختلف نعناع از مناطق مختلف ايران از جمله تهران، خراسان، آذربايجان غربي، اصفهان، کاشان، همدان، يزد، شيراز، کرمانشاه، آبادان و اهواز جمعآوري شدند و بر اساس محل جمعآوري نامگذاري گرديدند. اسامي ژنوتيپهاي متعلق به هر گونه، محل جمعآوري و شرايط آب و هوايي هر منطقه در جدول 4-1 نشان داده شده است. در ميان ژنوتيپهاي مورد مطالعه، 13 ژنوتيپ از مناطق با آب و هواي سرد (ميانگين دماي ساليانه 11 تا 17درجه سانتيگراد) و 27 ژنوتيپ از مناطق با آب و هواي گرم (ميانگين دماي ساليانه 19 تا 25 درجه سانتيگراد) جمعآوري گرديدند. محلهاي جمعآوري بر روي نقشه (شکل 4-1) نشان داده شده است.
4-2- ارزيابي صفات مورفولوژيک و محتواي اسانس توليدي
نتايج تجزيه واريانس برداشت سال اول و سال دوم براي صفات مورد مطالعه در جدول 4-2 ثبت شده است. در هر دو سال مورد مطالعه، بين ژنوتيپها و گونهها و اثرات متقابل گونه و ژنوتيپ از لحاظ کليه صفات، اختلاف معنيداري وجود داشت. به استثناي اثر متقابل ژنوتيپ و گونه بر صفت طول برگ در سال اول و ارتفاع در سال دوم و همچنين اثر گونه بر طول برگ که بدون اختلاف آماري معنيدار بودند. بدين ترتيب، نتايج حاکي از شرايط متفاوت آب و هوايي در طي دو سال مطالعه و تأثيرپذيري ژنوتيپهاي مختلف از شرايط آب و هوايي متفاوت در طي دو سال ميباشد.

ب
شماره
استان
دما (درجه سانتيگراد)
بارندگي (ميليمتر)
آب و هوا
1
آذربايجان غربي
86/1±5/11
404
سرد
2
همدان
83/1±3/11
328
سرد
3
کرمانشاه
54/1±3/14
427
سرد
4
اصفهان (سميرم)
55/1±2/17
409
سرد
5
البرز
62/1±9/14
248
سرد
6
قزوين
83/1±0/14
351
سرد
7
خراسان شمالي
24/1±1/16
253
سرد
8
خوزستان
37/1±3/25
161
گرم
9
مرکزي
97/1±9/21
192
گرم
10
اصفهان

پایان نامه
Previous Entries نور فلورسنت، انکوباتورها Next Entries منبع پایان نامه ارشد با موضوع ناخودآگاه، خودآگاهی، داستان کوتاه